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干细胞培养全攻略
过夜；也可室温(或浸于自来水中)化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰
(1)放入室温的水浴锅内开始加热(同时放入一个内装200ml自来水的血清瓶，
(2)当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟；若不小心使温度上
(2)取出，自然冷却至室温(约需1－3小时)，可分装或－20℃继续冻存；
2.在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸钠、抗生素等），
4.将鼠腹面向上放置，70%酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及
8.弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1—4次）；
13.弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10cm
若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用
0代ME细胞做Feeder,要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱
者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；
1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基
4.弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2—3mLPBS,轻轻摇动，弃去PBS,
如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有
24.加入适量胰酶消化30秒,吸去消化液,静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁
为止,加入培养基,吹打,种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀,可再补加丝
裂霉素处理过的细胞）,半小时后即可使用（如果急用,则可以用ES细胞培养基终
止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6—10天,用前
更换培养液（如未用明胶处理培养皿,则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；
Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早
2.准备37－39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管（冻存细胞），迅速投
4.弃上清，加入1mlES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿
5.转入培养箱培养，次日换液；此后每24小时换一次液，每48小时传一次代
4.5cm培养皿约3mL培养基；若死细胞较多则可以先用PBS 洗一次，再加 培
2 .提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱
3 .将ES 细胞培养皿、Feeder 细胞培养皿从培养箱内取出（相差显微镜下作 常
规观察，Feeder 细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养 皿面
积）；ES 细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均 匀，
集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、 胞质少；
4 .将ES 细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL 左右洗一遍，加入胰
蛋白酶溶液，作用约 30 秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去；再作用 1—5 分 钟，
不时观察，待细胞层（皿底一层白色脏东西样膜）出现裂缝并明显开始下 滑时，
补加培养基，适度吹打（视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的 大的细胞
团块为止）；平均分到Feeder 培养皿中（滴加，以免将Feeder 细胞吹 脱落下来），
滴加补加培养基至5ml 左右（滴加，以免将Feeder 细胞吹脱落下 来；若为
6 .前后左右水平晃动培养皿，使ES 细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱 继
配适量冻存液（为含10%二甲亚砜（DMSO），10% FBS 的DMEM培养 液）；
弃上清，每管加入1ml 冻存液，吹打成细胞悬液（只要使ES 细胞分散成 3—5
