联系热线：0577-65576766
生物制药之细胞库建立要点
细胞库是我们生物制药的源头，是重中之重，必须有一份详尽的细胞库测试规范和流程，用以证明我们所生产的生物制药产品的安全性、纯度、理化指标和有关药效的指标。
生物制药的研究者应该掌握细胞库建立方面的技术，无论是准备用于GMP生产，还是在研究阶段的主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）、生产结束（EOP）细胞库、研发（R＆D）细胞库（CB）的建立都需要良好的专业知识；当然还有比较先进的设备和环境、良好的质量控制和持续监控、人员之间的密切沟通并持续进行问题排除和研究。此外，表征这些细胞系统的实验过程可能很广泛和复制，需要有针对特定细胞的一系列测试。从构建测试到身份和遗传稳定性测试，重要的是研究人员需要清楚的了解细胞库建立的检测项目，以及何时进行这些测试的最佳时间和测试如何影响整个研究项目进度和结果。
生产用MCB定义为单个细胞池的等分细胞样品，通常是在限定条件下从选定的克隆中制备单个细胞，然后分配到多个容器中，并在限定条件下进行存储。MCB通常来自研究细胞库，它是细胞系构建筛选的“终点”。从在限定的培养条件下培养MCB获得的均质细胞悬液制备WCB。
通常根据研究进程对细胞库进行分类：R＆D CB（研发），MCB，WCB和EOP CB。另一种常用名称反映了细胞库用途及是否是GMP状态：非GMP细胞库（或R＆D细胞库，GMP非生产用细胞库（例如用于生物测定的细胞库）和GMP生产用细胞库。
通常，在GMP生产中，非GMP（R＆D）细胞库是按照与GMP库相同的一般规则和条件来准备的；但是，并不需要严格遵守GMP。GMP非生产细胞库通常以非生产模式生产，这意味着可以在同一实验室中同时制造和培养多个细胞库。在这种情况下，必须使用适当的清洁和转换程序来避免细胞之间的交叉污染。GMP非生产细胞库通常在基于细胞的效能测定中用作检测和鉴定的细胞。
最近，对即用型生物测定细胞库（RTU）的需求有所增加。这种细胞库的目的是在生物测定中直接使用来自小摇瓶的细胞，从而省去了细胞扩增步骤并节省了过程时间。RTU库通常较大（400-1000个以上的样品瓶），每个样品瓶有大量的细胞。高细胞活率（80％甚至90％）是研究者的普遍期望，因此，从小型研究细胞库扩展到规模庞大的细胞库时，存在潜在的风险问题，因此强烈建议进行更多的研究。
GMP生产用细胞库大多以正规生产模式生产建立，这意味着一次只能在一个细胞库建立中生长建立一个细胞系。GMP生产细胞库中的细胞用于制造生物药物产品，所以GMP生产细胞库的细胞的生存活率预期通常要70％。
为了确保细胞库的纯度和安全性，有必要彻底、准确的风险评估来设计和实施全面的测试检测程序。作为评估的一部分，重要的是要考虑已准备好细胞库的类型，因为进行检测的原理因所生产的细胞库的类型的不同是有所不同的。例如，用于非生产性细胞库（用于分析测定的细胞）或用于扩展以创建MCB的种子细胞的检测程序通常比为生产性细胞库实施的检测程序要简化得多。
对所有细胞库的检测应包括支原体和无菌检测，还应该在将细胞带入清洁设施或车间之前就进行这些检测以免污染洁净区。无菌测试可确保细胞不含细菌、真菌和霉菌，这些细菌、真菌和霉菌可通过受污染的细胞，使用受污染的动物或植物来源的原材料、操作人员或将污染引入洁净区的设施。按照药典方法进行无菌测试，重要的是，在无菌测试之前要进行抑菌和真菌测试，以评估样品培养基质是否对检测有抑制作用。
同样，支原体是一种常见的细胞培养污染物，通常来自细胞本身，添加剂或实验室人员。支原体污染不仅会导致细胞代谢变化，最终影响产品的产量和质量，而且还与许多人类疾病有关。因此，重要的是要确保细胞对支原体测试呈阴性。按照药典方法进行标准支原体测试，理想情况下应该在常规测试之前进行支原体测试，以评估样品基质的抑制作用。鉴于支原体测试需要四周才能完成，因此已经开发出了快速的方法，这些方法显示出可比的敏感性，只需几天即可完成。所以，对于非生产种子细胞，支原体和无菌性通常是唯一执行的生物安全性测试。对于打算用于分析测试的非生产型细胞，附加的表征测试应着眼于特定细胞在其预期的生物测定中的性能测试。
法规对生产细胞库测试的期望比非生产细胞库需要更高的表征水平。MCB是整个生产过程的原材料。监管部门的要求是，对于已经检测过的微生物以及包括外源性因子在内的病毒性因子，它们均具有充分的特征。除非对细胞库进行了更改，否则此测试仅执行一次，在这种情况下，应对新的细胞库进行重复测试。由于WCB仅是MCB之外的一小部分，因此减少测试是可以接受的。这种简化的测试通常包括无菌，支原体和最少的病毒测试。体外极限细胞寿命（CAL）或EOP库被认为是扩增存在的任何污染物的最坏情况。这些细胞库还需要进行一次完整的特性测试。请参阅下表I，以了解每种细胞库的监管测试摘要。
像已经讨论过的微生物制剂一样，病毒制剂可以通过原材料（例如细胞或原料）以及从操作员或受污染的设施中引入。牛血清和胰蛋白酶等原材料仍然是该行业中病毒污染物的常见来源。在设计病毒测试计划时，了解细胞库的整个研究并进行全面的风险评估至关重要。细胞系是否已暴露于血清或胰蛋白酶？如果是这样，是否受到了辐射？尽管可能不再在生产过程中使用基于动物的原材料，但是如果这些试剂在细胞的过去的研究历史中曾使用过，它们仍然是一个令人担忧的问题，并且必须在测试计划中加以解决。细胞系是否暴露于其他细胞物种或源自其他物种的物质？细胞接触过哪些非动物性添加剂？细胞系易感染哪些病毒？这些都是进行风险评估和制定测试计划时应考虑的重要问题。
病毒制剂的表征测试包括在检测未知病毒的常规广泛筛选分析以及针对特定病毒的测试。进行了广泛的常规筛选测试，以检测未知范围的可能污染物。这些测试包括体外病毒测定，体内病毒检测和电子显微镜检测。还存在许多检测与特定关注物种相关的污染物的检测方法。进行牛和猪的筛选试验，以鉴定血清或胰蛋白酶中的污染物，以及基于产品特定关注点的人或啮齿动物筛选试验。还存在许多检测逆转录病毒的方法，逆转录病毒可以是偶然的或内源的（已知整合入宿主细胞基因组的病毒）。
体外病毒检测，选择了多种指示剂细胞系并用于检测病毒污染物。在细胞裂解液样品中接种细胞，并在数周的过程中观察病毒感染的迹象（细胞病变效应[CPE]，红细胞的血吸附[HAD]，红细胞的血凝[HA]）。选择用于测试的指标细胞时，重要的是要根据其对相关病毒的理论敏感性来选择它们。人类二倍体细胞系（MRC-5）和灵长类细胞系（Vero）始终用于检测对人类细胞具有传染性的病毒。选择与被测试的细胞库底物具有相同或相似细胞类型的第三种指示剂细胞系，以检测对那些细胞具有传染性的病毒。可以添加其他细胞系来解决特定的病原体。例如，可以将A9或324K细胞添加到测试板中，以检测鼠类微小病毒（MMV）（一种常见的工业污染物）。与无菌和支原体检测一样，建议在常规检测之前进行基质干扰检测，以评估任何样品的抑制或毒性问题。
体内病毒测定法也是用于检测未知病毒的广泛筛选测定法。理由是在动物系统中可能会检测到某些在细胞培养系统中不会引起CPE或其他明显影响的病毒。体内测试包括将细胞裂解液接种到哺乳和成年小鼠，豚鼠和有雏鸡的卵中（羊水和卵黄囊）。然后在测试的每个工作日观察动物的临床体征。
对特定物种的病毒进行测试也是病毒测试计划的重要补充，其使用基于风险评估。最常见的物种特异性检测包括牛或猪的检测，这通常是由于当前或过去分别暴露于血清和胰蛋白酶引起的。测试包括用细胞裂解液样品接种指示细胞，并在几周内观察CPE和HAD的细胞。然后根据法规（9CFR）和欧洲药品管理局的测试要求，对细胞进行染色，检查是否存在许多特定的牛或猪制剂。
对于在啮齿动物细胞中制备的生物制药产品，啮齿动物病毒的存在是一个重大问题，因为许多啮齿动物病毒都能够在人类细胞中复制。在这些情况下，可以进行抗体测试，这是检测不定源啮齿动物病毒的灵敏方法。给无病毒抗体的动物注射测试物品，并在温育期结束时进行血清学分析，以确定是否产生了针对特定病毒的抗体。测试可以在小鼠，大鼠或仓鼠中进行。
考虑将病毒特异性实时聚合酶链反应（qPCR）分析添加到测试中以检测在先前描述的分析中未检测到的特定病原体也可能很重要。现在提供了专门用于检测猿猴，人，犬，禽或昆虫病毒的PCR板。
细胞表征风险评估的最后一个关注领域是逆转录病毒测试。尽管这些试剂是不定性的，但许多是啮齿动物细胞系的内源性。由于逆转录病毒与严重的免疫抑制和退化性疾病有关，因此它们是主要的安全问题。因此，重要的是要证明没有传染性逆转录病毒。逆转录病毒具有在细胞内保持潜伏的能力，并且可以在没有明显的细胞病理学，HA或HAD的情况下感染并复制。特定的共培养程序对于检测传染性逆转录病毒是必需的。在所有这些测定中，易感靶细胞与目的细胞系共培养。对靶细胞进行亚传代，以扩增存在的任何逆转录病毒，对不定因子的测试对于确保细胞库和所得生物制药产品的安全性和纯度至关重要。重要的是执行彻底而准确的风险评估以准备测试计划，并留出足够的时间完成测试，因为许多测试需要数周或数月才能完成。下表二显示了各种测试的标准时间表。考虑测试结果时，也必须考虑分析结果的含义。例如，基于细胞的检测和动物检测可检测传染性病毒。另外，这些方法中的许多方法都包括扩增过程，以提高测定的灵敏度。但是，分子检测法检测的是基因序列而不是传染性病毒，并且可能会通过检测可能不会导致感染的病毒片段而导致“假阳性”结果。我们知道基于细胞的测定和分子测定的结果很重要，但同时记录和分析这些测试结果也很重要。
遗传稳定性测试是生产细胞库表征的关键组成部分，这也是一项法规要求。通过将表达载体稳定转染到宿主细胞系中来创建典型的哺乳动物生产细胞系。在随后的细胞培养过程中，可能会发生基因组事件，例如缺失，重排和点突变，并导致细胞表型或基因表达谱的改变。细胞系的不稳定性非常令人担忧，因为它可能会对产品的完整性产生负面影响，从而给患者带来风险。即使在不影响产品完整性的情况下，从操作的角度来看，细胞生产力的降低和未来可能的不稳定性事件的风险仍然是备受关注的问题。
遗传稳定性测试通常包括在制造商的MCB，EOP以及通常为WCB上进行的一系列分析。典型的测定包括但不限于在确认产物转录本完整性的测定（mRNA/cDNA测序和Northern分析），整合位点的基因组结构（通过Southern分析的限制性酶切图）以及插入物的比例相对于宿主基因组的基因拷贝数（通过qPCR或Southern分析）。最近，业界已经讨论了使用下一代测序技术进行全基因组测序，作为确认遗传稳定性，并进一步增强细胞系特性的方法。
除了遗传稳定性测试外，另一个重要的细胞库表征测试是身份测试。直到最近，最常使用同功酶分析进行身份测试，该分析基于在琼脂糖凝胶上电泳时细胞裂解液中一组选定的酶的迁移模式提供了一般形态。该方法有几个局限性，例如灵敏度低和数据解释困难。除了技术上的局限性外，目前单一来源的测试方法的短缺突出表明了对替代身份测试方法的迫切需求。在可能的替代方法中，由于种间特异性高以及广泛的序列数据库的可用性，细胞色素氧化酶I条形码方法已成为最先进的方法。为了进一步验证人类细胞系，遗传稳定性测试和身份测试均应在每个MCB和一个代表性的EOP细胞上进行。WCB的基因稳定性测试是可选的，但可以由制造商决定是否进行。将EOP和WCB的遗传稳定性测试结果与MCB的遗传稳定性测试结果进行比较，以检测可能表明不稳定性的任何变化。当制造工艺发生变化时，可能需要对另外一批EOP细胞进行遗传稳定性测试。
在生物细胞学研究中，有时需要体外培养和分析癌细胞。细胞要养好，就要用好血清，如Ausbian®特级进口胎牛血清，它的内毒素小于3Eu/ml，使细胞更健康，客户做实验更加顺利。
