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细胞培养工作流程
· 注意全程无菌操作 · 溶解冻存细胞时速度一定要快 ，避免缓慢升温细胞内形成冰
晶 ，对细胞造成损伤 · 计算合适的接种密度 ，一般CHO细胞培养的接种密度范围在
3.0-6.0*10E5个/ml · 注意安全：取出冻存管时防止冻伤 ， 同时注意有无液氮渗透
· 将水浴管 ，用镊子夹住迅速放入水浴锅中晃动， 直至完全溶解后将冻存管表面消毒转移至超净工作台内进行 操作
· 将细胞悬液转移至15ml离心管内，加入约10ml培养液，轻 轻吹打混匀
· 非贴壁依赖型细胞的一种培养方式 · 细胞悬浮于培养基中生长或者维持 · 某些贴壁依赖型细胞经过适应和选择后也可
液打入反应器进行扩培 · 当反应器内细胞密度达到要求后 ，接种至下一级反应器开始
SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。
二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。
悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。
细胞传代方法： 传代指针： 观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊 显微镜观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，铺满培养瓶80%以上，细胞透亮，形态清晰，间隙无杂质，确认无细菌真菌污染
将新的培养皿、吸管、废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒20分钟， 开启恒温水浴箱，培养液、消化液预热 关毕紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯 吸弃培养基，PBS清洗两次 加入2ml消化液晃动培养瓶使消化液覆盖整个细胞界面后吸弃培养液 肉眼观察细胞培养瓶底部出现一层云雾状，轻轻敲打底部有块状物脱落，显微镜下观察看到细胞间隙变大，细胞回缩变圆少量漂浮后加入10ml含血清培养基终止消化，吹打管吹打数次 将细胞悬液吸至离心管，1000rpm离心5分钟 吸弃上清，加入PBS吹打混匀， 1000rpm再次离心5分钟 吸弃上清，加入新鲜培养基，吹打混匀，按比例接种到细胞培养瓶
细胞计数板计数室构造 数红色边框标记的四个方格内的细胞总数（如有压线则计上不计下，计左不计右） 细胞数/ml=（4个大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数
实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射20-30分钟灭菌，以75 %酒精 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
悬浮细胞培养流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
细胞培养工作流程细胞培养是一种将动植物细胞在体外条件下进行繁殖和生长的技术。
它是许多生物学研究和应用领域的重要工具，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药物研发、生物工程等领域。
细胞培养的工作流程包括以下几个主要步骤：2.细胞株的建立：细胞株是一组具有相同遗传特性的细胞，通常可以通过原代培养、扩增和传代等方法建立。
原代细胞通常来自新鲜组织，将其接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中，细胞在适宜条件下会开始生长和分裂形成细胞株。
3.细胞培养基的选择：细胞培养基是提供细胞生长和繁殖所需的营养物和生长因子的培养介质。
4.细胞的传代：细胞在培养皿中进行繁殖和分裂，当细胞密度达到一定程度时，需要将细胞进行传代以保持细胞的健康和增殖能力。
传代的目的是将细胞分离并分散在新的培养皿中，以便细胞可以继续生长和繁殖。
5.细胞的准备和植入：根据实验设计和研究目的，将所需的细胞接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中。
细胞培养条件通常包括适宜温度（通常为37摄氏度）、无菌条件、恒定的pH值、适宜的气氛（如5%CO2），以及提供细胞所需的营养物和生长因子。
6.细胞的观察和维护：细胞在培养过程中需要定期观察其生长状态和形态特征。
细胞的培养过程中还需要定期更换培养基，补充营养物和生长因子，以维持细胞的正常生长和繁殖。
7.细胞的实验应用：培养的细胞可以用于各种不同的实验研究和应用，包括细胞分离、细胞特征分析、药物筛选、基因表达研究等。
细胞培养的基本操作细胞培养是一项重要的生物学技术，在生物医学研究和药物研发中被广泛应用。
一、实验前准备工作1、选用适合细胞培养的培养基及其配方，并对不同类型的细胞培养进行区分；2、准备好所需工具，包括细胞培养罐、离心管、移液器、培养皿、培养层等；3、需要准备好无菌工具，包括无菌帽、无菌手套、消毒布、培养皿贮存架和培养皿启封器。
二、细胞传代工作流程1、收集培养好的细胞，用离心机离心沉淀；2、用1X PBS（磷酸缓冲盐水）将细胞沉淀洗涤，移至新的细胞培养罐中；3、用细胞消化剂消化，将细胞与培养基混合均匀；4、将细胞移至新的培养皿中；5、将新培养皿置于CO2培养箱内，放入37℃恒温培养箱内暴露于5%CO2气氛下培养。
三、培养基的配制方法1、根据所培养细胞种类和培养目的选取适当的培养基配方；2、按配方要求称取所需材料；3、先将酸性胶原与缓冲液混合均匀，然后逐渐加入其他成分，制成完整的培养基；4、使用培养基前要进行质量控制，如pH值测定、Osmolity测定等，以确保培养基质量良好。
四、细胞结构和形态检测1、用无菌的PBS洗涤细胞，将细胞置于培养皿中；2、用甲醛固定处理，使细胞组织固定在培养皿里，然后进行染色处理；3、可以使用相位对比显微镜或荧光显微镜对细胞形态进行观察和记录；4、通过对细胞形态和生长情况的观察和分析，判断细胞是否正常培养。
以上四部分就是细胞培养的基本操作流程，若能完全掌握上述技巧和操作细节，无疑将极大提高细胞培养实验的成功率。
在操作过程中，应保证操作环境和工具设备的无菌干净，切勿影响实验进程或结果。
细胞培养车间工作流程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。
准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。
二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。
取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。
如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。
如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。
细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程1．原代培养（primary culture）直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。
2．传代培养（subculture）细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。
培养时通过一特殊的装置，使细胞瓶按一定的速度不断地转动，使细胞始终处于悬浮状态中进行增殖。
4．克隆（clone）克隆指的是从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population）。
5．细胞系（cell line）在第二届细胞和组织培养专题讨论会上提出细胞系的概念为“原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（lineages of cells）所组成。
如果不能继续传代或传代数有限，可称有限细胞系（finite cell line），如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continous cell line）。
以前认为细胞系来自细胞发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限的传下去。
6．细胞株（cell strain）细胞株的概念如下：由原代培养中，用选择或克隆代，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株，这些特性或标记在以后的培养中必须保持下去。
以前认为经体外传代培养后细胞不表现退化现象，大约可传50代以上者，其染色体维持二倍体不变，保留正常细胞的“接触抑制”等特性。
一常用设备一准备室的设备：双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
细胞体外培养实验流程一、细胞复苏1.准备：紫外照台30min,准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基含FBS,水浴箱开启到37℃,75%乙醇清洗双手,培养基用前37℃温育20min,酒精擦拭后放入无菌操作台,点燃酒精灯;2.灼烧离心管管口、塞子和滴管,用滴管取5mL培养基加入离心管中;3.戴好防护用具,从液氮中取出冻存管后立即放入37℃水浴箱中,轻轻摇晃冻存管,保证细胞1min内融化;以75%酒精擦拭冻存管外部,移入无菌工作台;4.用吸细胞液的从冻存管中将细胞悬液完全吸出加入到已装有培养基的离心管中,塞子塞离心管,2000rpm,离心4min,弃上清;5.往离心管中加培养基含FBS5mL,用吸细胞悬液的滴管轻轻吹打,使细胞混匀,将离心管中的细胞悬液全部吸出加入到培养瓶中,培养瓶平放,轻轻晃动,使细胞均匀贴壁,标记好细胞名称、日期、培养人,放入37℃,5%的CO2恒温培养箱培养;6.收拾所用物品,75%酒精喷洒消毒;注意：1.离心时转速太高,离心时间过久都易对细胞造成伤害;2.滴管一定要严格分开,不能混用,防止细胞污染;3.DMSO常温下对细胞毒性较大,故冻存细胞复苏后应立即洗涤冷冻保护剂;二、细胞换液1.将培养瓶从CO2培养箱中取出,倒置显微镜下观察细胞生长状态判断生长情况,并确证未发生污染后转入无菌操作台内;2.准备：紫外照台30min,准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基含FBS,水浴箱开启到37℃,75%乙醇清洗双手,培养基用前37℃温育20min,酒精擦拭后放入无菌操作台,点燃酒精灯;3.酒精灯外焰灼烧培养瓶瓶口、瓶塞和滴管,培养瓶倾斜,吸出旧液,尽量吸净;4.吸取培养基含FBS5mL,加到培养瓶中FBS终浓度为10%;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次,再加培养基;5.将培养瓶与瓶盖过火,旋紧瓶塞后回旋半圈,平放回CO2培养箱;6.收拾所用物品,75%酒精喷洒消毒;注意：1.打开和盖紧培养基、培养瓶前后均需旋转灼烧瓶口和瓶盖;2.各滴管一定要严格分开,不能混用;3.将PBS注入到培养瓶中,应将液体打到没有细胞的那一面;4.培养液以没过细胞为宜;5.细胞溶液变黄或死细胞过多时换液;6.倒掉培养瓶中的培养液,瓶口应尽量远离废液缸,以免造成污染三、细胞计数和活力测定一细胞计数细胞数/mL=4大格细胞总数/4104稀释倍数1.紫外照台30min,75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板,用干纱布或棉签再擦一遍,放好盖玻片;2.用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中吸出少许,滴加在盖玻片边缘,使悬液充满盖玻片和计数板之间,静置3min;3.观察计数：压线的记左不计右,记上不记下,成团细胞只记为1个;先用4倍镜找出大位置,再用10镜计数;4.计数完用75%酒精棉签擦洗盖玻片和计数板;二细胞活力测定1. 紫外照台30min,吸取细胞悬液加入试管中;2. 加入%台盼兰染液,染色2～3min;3. 吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片;4. 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力;死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状;注意：1.细胞计数时盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边凹槽中;2.活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用;四、细胞传代1.配完全培养基：基础培养基:FBS=1:92.取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代 ;3.紫外照台30min,75%酒精擦拭双手,将预热后的培养基、PBS、胰酶培养基等用酒精擦拭后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台;4.点燃酒精灯,将培养瓶用75%酒精擦拭后移入工作台,将瓶口和瓶盖过火灼烧;5.在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,用适量PBS清洗细胞表面,并弃去PBS;6.加入1mL %胰酶消化细胞,此时可将细胞置于37℃细胞培养箱内消化;胰酶以铺平培养瓶底部为宜;倒置显微镜下观察,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度一般2-5min;立即弃去消化液加入3mL完全培养基终止消化;注意更换吸管7.用吸细胞液的滴管轻柔吹打,保证培养瓶底的每个角落都吹打到,斜坡处不能忽略,把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入离心管中,再用滴管吹打混匀细胞悬液;8.取一滴细胞悬液进行计数,计算好细胞传代培养时稀释倍数细胞传代密度不低于5105个/mL;9.传代：先用滴管吹打混匀细胞悬液,按一定比例稀释,标记好细胞名称,传代培养时间,培养员,细胞个数,平放入CO2培养箱继续培养;10.收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台;附：培养细胞若需给动物注射,在消化后用PBS清洗3-5次后收集细胞并计数,用PBS清洗细胞是为防止给动物注射时残留的FBS造成动物炎症;注意：1. 对于难消化的细胞在用胰酶消化前,先用1～2mL 4 ℃PBS冲洗一遍,较易消化的细胞不需要此步骤;2. 一定要防止细胞过消化因过消化,使细胞成团,不均匀,且对细胞伤害很大,影响细胞贴壁和导致生长状态差等;过消化特征：a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落,胰酶里出现很多悬浮物,为掉下来的细胞;b.培养瓶底板上本身为白茫茫细胞贴壁生长,而过消化后细胞脱壁掉下来,则可见培养瓶底板有一片片空隙;出现过消化时立即加入含FBS的培养基终止消化;3. 把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时,每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体,以防止细胞成团不均,用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害,影响在培养瓶中生长;5. 一般细胞生长铺至瓶底约80%,则可传代或用来做实验,否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化,不易用于后续实验;五、细胞冻存1.选对数增生期细胞证明无支原体污染,在冻存前1天换半量或全量培养基;与冷冻细胞应生长良好且存活率高,约为80-90%致密度;2.配制冷冻保存溶液使用前配制：另取一离心管,加入培养基、FBS10%,逐滴加入二甲基亚砜DMSO至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用; 3.依细胞传代培养的操作,收集细胞于离心管中,取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率,一般细胞冻存浓度为1-5106个/mL;4.离心管管口和管塞过火灼烧,塞好后,2000rpm离心4min,去上清,加适量完全培养基,混匀;5.取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液DMSO最后浓度为5～10％,使细胞浓度为1～5106cells/mL,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1～2mL/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测;严密封口后,注明细胞名称、代数、日期;6.4℃静置10min,-20℃静置30min,-80℃过夜放置,液氮槽冷冻保存;。
细胞培养工作流程细胞培养指的是将体外细胞放入适宜的培养基中，通过人工控制环境提供养分、温度、湿度和气氛等条件，使细胞能够在体外生长和繁殖的过程。
它是现代生物科学研究的重要手段之一、下面是细胞培养的基本工作流程：1.选择细胞系：根据研究目的，选择合适的细胞系进行培养。
常用的细胞系包括动物细胞系（如人类细胞系、小鼠细胞系）和植物细胞系（如拟南芥细胞系、水稻细胞系）等。
2.培养皿处理：将培养皿（常用的有细胞培养板、细胞培养瓶等）进行反应器瓶内蒸气温度消毒，消毒完后平行设置以备用。
基本培养基是常规使用的培养基，包含至少4个组分：基础培养液（如DMEM、RPMI1640等）、热灭菌的胎牛血清、青霉素-链霉素溶液和培养液调节剂。
特殊培养基则根据细胞系的需要，添加特定的因子和配方，以满足特殊细胞的生长和繁殖要求。
首先需要将细胞接种得到的细胞进行计数，根据细胞密度和细胞系特性合理的安排接种密度。
常见的条件有：温度通常为37℃，CO2浓度通常为5%，相对湿度约95%。
细胞一般分为贴壁生长和悬浮生长两种，贴壁细胞需要定期更换培养基，悬浮细胞则需要掌握细胞的密度从而进行传代。
7.细胞传代：当细胞密度到达一定程度（通常为80-90%）时，需要进行细胞传代，以维持细胞的生长和繁殖。
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细胞培养流程细胞培养是生物学实验中常用的一种技术手段，通过细胞培养可以使细胞在体外环境中持续生长和繁殖。
细胞培养流程包括细胞的分离、传代、培养和检测等步骤，下面将详细介绍细胞培养的流程及注意事项。
细胞传代是指将细胞从一个培养皿中移植到另一个培养皿中，以维持细胞的生长和增殖。
在进行细胞传代时，需要注意细胞的密度和培养基的配比，以确保细胞的正常生长和分裂。
细胞培养是指将分离和传代后的细胞放置在含有营养物质和生长因子的培养基中进行培养。
培养基的选择和配制对细胞的生长和表型具有重要影响，需要根据不同类型的细胞进行合理选择。
在细胞培养过程中，需要对细胞进行定期的检测，包括形态学观察、生长曲线分析、细胞纯度检测等。
通过对细胞的检测，可以及时发现细胞的异常情况，并采取相应的措施进行处理。
细胞培养过程中需要注意的事项：保持无菌操作，细胞培养过程需要在无菌条件下进行，避免细胞受到外界污染。
控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等，确保细胞在适宜的环境中生长。
定期更换培养基，培养基中的营养物质和生长因子会随着时间逐渐耗尽，需要定期更换新的培养基。
总之，细胞培养是一项复杂而又重要的实验技术，正确的细胞培养流程和操作规范对于细胞生物学研究具有至关重要的意义。
希望本文介绍的细胞培养流程及注意事项能够对您有所帮助，祝您的细胞培养工作顺利进行！。
细胞培养标准操作程序（SoP1.目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
3 •操作规程：3.1培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 100Oml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2〜3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCo3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml 10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2〜3个过滤器、注射器。
6、配青霉素80万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml ,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22Um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20 C保存备用。
注意：（1 ）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
（2）准备的100ml 10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
实验题目：细胞传代实验材料：细胞培养箱，安全柜，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，记号笔，冰箱实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤一．实验前准备工作：进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37℃水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。
二．.准备实验：先关闭紫外等30min后再进行实验；75%酒精喷于纸上，将超净工作台仔细擦试干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。
1．吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。
2．消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。
3．中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mLDMEM培养液终止消化。
将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。
5．重悬细胞：离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。
实验题目：细胞传代实验材料：细胞培养箱，安全柜，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，记号笔，冰箱实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤一．实验前准备工作：进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37℃水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。
二．.准备实验：先关闭紫外等30min后再进行实验；75%酒精喷于纸上，将超净工作台仔细擦试干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。
1．吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。
2．消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。
3．中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mLDMEM培养液终止消化。
将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。
5．重悬细胞：离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。
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细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1、1工作地点检查:检查台面、地面就是否洁净,确认无不相关物品。
1、3层流罩准备:开启层流罩,观察其运行就是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
1、4操作工具与试剂检查:检查本次操作所用灭菌物品外包装就是否严密,就是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内就是否有异物,瓶表面就是否有裂纹,瓶塞就是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期就是否符合要求。
复苏、换液用液体:MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3溶液。
1、5复苏用水准备:(1)融化种子用溶液:按1L/1支种子准备391℃含0、1%新洁尔灭溶液。
(2)百级内消毒种子用水:1L/1支种子准备36、51℃含0、1%新洁尔灭溶液。
1、6操作人员进入层流罩:穿一层无菌连体服并戴无菌手套,静止5分钟后方可操作。
1、7溶液使用前处理:辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面,旋转1周,操作人员将翻塞翻开,再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液配方辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中,每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧,在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。
操作人员将培养瓶(T175)盖打开,倾斜或直立放置酒精灯附近,将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0、3～0、4 ml/cm2),拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
4、种子速溶种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时,在液氮罐颈部停留几秒,核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容就是否一致。
核对无误后,迅速全部浸入391℃含0、1%新洁尔灭溶液(1000ml /支种子),顺时针不停摇动直至融化,将每次的速融时间控制在1分钟内。
迅速传递并浸入百级内36、51℃含0、1%新洁尔灭溶液中,百级内操作人员取出擦干。
5、移种操作人员左手拿冻存管,右手打开,用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出,缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中,拧紧瓶盖。
6、培养辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。
7、清场将废液倒入下水道,废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间, 层流罩内用75%酒精消毒,再用纯水清洁整个房间。
8、复苏后观察第二天观察培养液颜色(PH)就是否正常,在显微镜下观察细胞形态数量。
用消毒剂擦拭表面后放入层流罩,操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。
辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面,操作人员将翻塞翻开,再用火焰消毒瓶口及瓶塞。
操作人员右手拿住培养瓶底部,左手拧开瓶盖,轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。
辅助人员打开装生长液的瓶口,并将其在火焰外焰旋转1圈后,放置盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近,将生长液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0、3～0、4 ml/cm2)。
最后按规定清场二、细胞传代流程1、准备1、1工作地点检查:检查台面、地面就是否洁净,确认无不相关物品。
1、3层流罩准备:开启层流罩,观察其运行就是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
1、4操作工具与试剂检查:检查本次操作所用灭菌物品外包装就是否严密,就是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内就是否有异物,瓶表面就是否有裂纹,瓶塞就是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期就是否符合要求。
细胞传代用液体:MEM液,新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3溶液、0、01MPBS溶液、细胞消化液(含0、25%的胰蛋白酶溶液)。
2、传代1操作2、1配液配方向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3。
2、2洗涤辅助人员将PBS打开,用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
(加量:0、2～0、4 ml/cm2)盖上盖子,PBS交由辅助人员盖紧塞子,标记用量、日期。
2、3消化辅助人员将消化液瓶口打开,将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员用吸管吸3ml细胞消化液到培养瓶底,(消化液加量:0、02~0、04 ml /cm2)盖好瓶盖。
操作人员翻转培养瓶,使细胞消化液铺满整个细胞面,静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶,使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中,盖紧瓶盖置36、50、5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项:细胞培养瓶开盖后最好要45倾斜,操作完成后马上盖好盖子。
操作人员将消化好的培养瓶打开,用吸管吸10ml至T75 cm2瓶中,用吸管冲洗下细胞,吹打分散,制成均匀的细胞悬液。
2、5分种操作人员将细胞悬液平均分种至2个T175 cm2培养瓶中,,加生长液至75ml。
2、6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在2个T175 cm2细胞培养瓶上,将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。
2、7清场按规定清场2、8观察每天观察细胞生长状态3、传代2操作3、1配液配方向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3。
3、2洗涤辅助人员将PBS打开,用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
(加量:0、2～0、4 ml/cm2)盖上盖子,PBS交由辅助人员盖紧塞子,标记用量、日期。
3、3消化辅助人员将消化液瓶口打开,将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底,(消化液加量:0、02~0、04 ml /cm2)盖好瓶盖。
操作人员翻转培养瓶,使细胞消化液铺满整个细胞面,静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶,使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中,盖紧瓶盖置36、50、5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项:细胞培养瓶开盖后最好要45倾斜,操作完成后马上盖好盖子。
操作人员将消化好的培养瓶打开,将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中,每瓶倒入量:75ml,用吸管冲洗下细胞,吹打分散,制成均匀的细胞悬液。
3、5分种操作人员将细胞悬液平均分种至8个T175 cm2培养瓶中,加生长液至75ml。
3、6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞培养瓶上,将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。
3、7清场按规定清场3、8观察每天观察细胞生长状态4、传代3操作4、1配液配方辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口,拧松桶盖,操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道,左手将包装袋松动,一次性取出管道并放入MEM桶中,辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境。
辅助人员将所需溶液依次打开,操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内,加完后混匀待用。
注意事项:无菌吸管使用过程中禁止接触其她部位(除吸管后端的任何位置),如不慎碰到应立即废弃。
4、2洗涤辅助人员将PBS打开,用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
(加量:0、2～0、4 ml/cm2)盖上盖子,PBS交由辅助人员盖紧塞子,标记用量、日期。
4、3消化辅助人员将消化液瓶口打开,将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底,(消化液加量:0、02~0、04 ml /cm2)盖好瓶盖。
操作人员翻转培养瓶,使细胞消化液铺满整个细胞面,静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶,使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中,盖紧瓶盖置36、50、5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项:细胞培养瓶开盖后最好要45倾斜,操作完成后马上盖好盖子。
