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一种快速单细胞建库方法pdf
本发明提供了一种快速单细胞建库方法，该方法包括：1)裂解单细胞，释放所述单细胞中的全基因组DNA；2)向第1)步所得全基因组DNA加入Tn5转座酶，将DNA切割为DNA片段；3)对所得DNA片段进行PCR扩增，在扩增过程中引入索引条形码，为每个单细胞添加细胞索引条形码，PCR扩增试剂中还包含片段化终止液，以终止片段化；4)纯化扩增后的DNA片段，得到单细胞基因组文库。本发明还提供了集成于数字微流控芯片的快速单细胞全基因组建库方法，在前述方法基础上，将该方法集成于数字微流控芯片，实现自动化的文库构
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 114350748 A (43)申请公布日 2022.04.15 (21)申请号 5.5 (22)申请日 2021.12.30 (71)申请人 厦门大学 地址 361000 福建省厦门市思明南路422号 (72)发明人 杨朝勇张惠敏俞希远 (74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所 有限公司 35204 代理人 张松亭游学明 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806 (2018.01) C12N 15/10 (2006.01) C40B 50/06 (2006.01) 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图2页 (54)发明名称 一种快速单细胞建库方法 (57)摘要 本发明提供了一种快速单细胞建库方法，该 方法包括：1)裂解单细胞，释放所述单细胞中的 全基因组DNA；2)向第1)步所得全基因组DNA加入 Tn5转座酶，将DNA切割为DNA片段；3)对所得DNA 片段进行PCR扩增，在扩增过程中引入索引条形 码，为每个单细胞添加细胞索引条形码，PCR扩增 试剂中还包含片段化终止液，以终止片段化；4) 纯化扩增后的DNA片段，得到单细胞基因组文库。 本发明还提供了集成于数字微流控芯片的快速 单细胞全基因组建库方法，在前述方法基础上， 将该方法集成于数字微流控芯片，实现自动化的 文库构建。本发明方法免去预扩增步骤，但仍能 A 降低扩增偏倚，并获得更好的测序覆盖率，为CNV 8 和SNV分析提供有利信息，并大大缩短测序时间、 4 7 0 试剂和人力成本。 5 3 4 1 1 N C CN 114350748 A 权利要求书 1/2页 1.一种快速单细胞建库方法，所述方法包括以下步骤： 1)裂解单细胞，释放所述单细胞中的全基因组DNA； 2)向第1)步所得全基因组DNA中加入Tn5转座酶，将所述DNA切割为DNA片段，获得Tn5‑ DNA复合物； 其中，所述Tn5转座酶的用量为0.5～5ng； 3)步骤2)中所得DNA片段引入索引条形码，并进行PCR扩增，以为每段DNA片段添加测序 接头； 4)纯化步骤3)扩增后的DNA片段，获得单细胞全基因组文库。 2.根据权利要求1所述的快速单细胞建库方法，其特征在于，步骤2)中，Tn5转座酶的用 量为2‑4ng，优选3ng。 3.根据权利要求1或2所述的快速单细胞建库方法，其特征在于，步骤3)中，所使用索引 条形码包括N5、N7索引条形码，其中N5的序列为： 5‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[Ia]TCGTCGGCAGCGTC‑3； N7的序列为： 5‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Ib]GTCTCGTGGGCTCGG‑3； 其中，Ia和Ib分别代表N个任意碱基的组合，其中，n优选为6、7、8； Ia和Ib是相同的或不同的。 4.根据权利要求1或2所述的快速单细胞建库方法，其特征在于，步骤1)所述裂解通过 加入细胞裂解液进行，其中，所述细胞裂解液包括Tris‑HCl、EDTA、DTT和Protease K； 优选地，所述细胞裂解液为20‑100mM Tris‑HCl pH 8.0‑8.4，1‑5mM EDTA，5‑20mM DTT 和0.1‑1mg/ml Protease K； 更优选地，所述细胞裂解液为60mM Tris‑HCl pH 8.0，2mM EDTA，15mM DTT和0.5mg/ml Protease K。 5.根据权利要求1或2所述的快速单细胞建库方法，其特征在于，步骤2)中，在获得所述 Tn5‑DNA复合物后，通过加入终止液终止DNA片段化； 优选地，通过加入0.01％‑0.05％的SDS，更优选为0.02％的SDS，以终止DNA片段化。 6.根据权利要求1或2所述的快速单细胞建库方法，其特征在于，步骤3)中，所述纯化的 方法包括磁分离和/或柱纯化。 7.根据权利要求1或2所述的快速单细胞建库方法，其特征在于，步骤3)中，所述PCR扩 增的程序为70‑75℃1‑5min；95‑98℃10‑60s；95‑98℃10‑30s，50‑70℃10‑60s，65‑80℃1‑ 5min，循环次数为5‑30次，优选10‑25次，更优选为20次。 8.一种基于Tn5转座酶的单细胞全基因组建库方法，其特征在于，将权利要求1‑7任一 项所述的快速单细胞建库方法中的步骤1)‑步骤4)集成于数字微流控芯片进行。 9.根据权利要求8所述的单细胞全基因组建库方法，其特征在于，所述数字微流控芯片 包括试剂储液槽、单细胞分离区、扩增反应区、产物纯化区中的一个或多个的任意组合。 10.根据权利要求8或9所述的单细胞全基因组建库方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)利用所述数字微流控芯片分选单细胞； 2)裂解单细胞，释放所述单细胞中的全基因组DNA； 3)向第2)步所得全基因组DNA中加入Tn5转座酶，将所述DNA切割为DNA片段，获得Tn5‑ 2 2 CN 114350748 A 权利要求书 2/2页 DNA复合物； 其中，所述Tn5转座酶的用量为0.5～5ng，优选2‑4ng，更优选3ng； 4)向步骤3)中所得DNA片段引入索引条形码，并进行PCR扩增，以为每段DNA片段添加测 序接头； 5)纯化步骤4)扩增后的DNA片段，获得单细胞全基因组文库。 3 3 CN 114350748 A 说明书 1/9页 一种快速单细胞建库方法 技术领域 [0001] 本申请涉及单细胞测序领域，具体涉及单细胞全基因组文库构建领域。 背景技术 [0002] 单细胞测序技术是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测 序分析的一项新技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异 质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用。2013年《科学》杂志将 单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，认为单细胞测序技术将改变生物界和医 学界的许多领域。单细胞测序的临床价值在于分析临床样本中罕见的癌细胞、对肿瘤进行 早期诊断、发现新的药物靶标、检测可能对化疗产生耐药性的稀有克隆，从而指导化疗、非 侵入性监测，以及辅助生殖。 [0003] 单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新 技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖的、完整的基 因组之后，通过高通量测序得到单细胞的基因组信息，用于揭示细胞群体差异和细胞进化 关系。单细胞全基因组测序流程包括单细胞分离、全基因组扩增、测序文库构建及测序分 析。单细胞分离的方法包括显微操作、流式分选、有限稀释法、微流控技术等。单细胞基因组 学依赖于全基因组扩增(whole‑genome amplification,WGA)技术来扩增单细胞的基因组 DNA，以产生足够的核酸量用于测序。全基因组扩增方法包括简并寡核苷酸PCR(Degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP‑PCR)、多重置换扩增(Multiple displacement amplification，MDA)、多次退火环状循环扩增技术(Multiple annealing and looping‑ based amplification cycles，MALBAC)及转座子插入线性扩增(LinearAmplification via Transposon Insertion，LIANTI)。其中，DOP‑PCR简单、快速、廉价，但灵敏度低、错误率 高；MDA无需特殊仪器，具有保真性强的扩增能力，但起始模板量低时，扩增偏差大，对模板 质量要求高，可能产生非特异性产物；MALBAC操作简单、产量高，能够降低PCR扩增偏倚，使 得单细胞中大部分的基因组能够被测序，扩增均匀性显著优于其他技术，然而，当核酸模板 拷贝数极低时易扩增偏差，可能出现非特异性扩增；LIANTI精确度高、灵敏度高，但多步反 应、耗时长。 [0004] 在对单细胞基因组预扩增后，需要进行测序文库的构建。传统测序文库构建方式 需要经过DNA片段化、末端修复、接头连接、文库扩增、多次纯化分选等步骤，耗时较长。基于 Tn5转座子的建库方法是一种最近兴起的建库方法。首先用Tn5转座酶将测序接头连接到 DNA双链中，经过PCR完成文库扩增。将Tn5用于测序文库构建时，可将DNA片段化、末端修复、 接头连接等多步反应转变为1步反应，极大缩短建库时间，提高了工作效率。 [0005] 然而，已有的基于Tn5转座酶的测序文库构建试剂盒所需要的最小起始DNA量为 1ng，而单细胞的基因组含量仅为6pg，因此在建库之前需要对单细胞基因组进行预扩增，以 满足建库要求。 [0006] 通过预扩增可以获得更高覆盖深度和广度的测序结果，但也因此会导致扩增偏倚 4 4 CN 114350748 A 说明书 2/9页 和覆盖范围的丢失，并且扩增偏差降低了覆盖均匀性，从而掩盖了CNV(Copy number variant)的检测，而聚合酶的复制错误会导致错误的SNV(Single‑nucleotide variant)检 出。并且大多数WGA方法都具有流程繁琐、对扩增环境要求高、易污染、耗时、扩增试剂价格 昂贵等缺点，大大增加了测序样本制备的时间和试剂成本。 发明内容 [0007] 为解决上述现有单细胞全基因组测序分析存在的问题，本发明提出以下基于Tn5 转座酶直接片段化的快速单细胞全基因组建库方法，在操作简单、省时、低成本的基础上， 能够避免预扩增导致的扩增偏倚和覆盖范围丢失问题，从而满足在单细胞基因组含量(例 如，6pg)下免去预扩增实现单细胞直接建库，为CNV和SNV分析提供有利信息。 [0008] 一方面，本发明提供一种基于Tn5转座酶的单细胞全基因组建库方法，所述方法包 括以下步骤： [0009] 1)裂解单细胞，释放所述单细胞中的全基因组DNA； [0010] 2)向第1)所得全基因组DNA中加入Tn5转座酶，将DNA切割为DNA片段，获得Tn5‑DNA 复合物；其中，所述Tn5转座酶的用量为0.5～5ng。 [0011] 3)对步骤2)中所得DNA片段进行PCR扩增，在扩增过程中引入索引条形码，以为每 个单细胞添加细胞索引条形码，PCR扩增试剂中还包含片段化终止剂液，以终止片段化； [0012] 4)纯化步骤3)扩增后的DNA片段，获得编码好的单细胞全基因组文库。 [0013] 本发明中，单细胞的获取可使用本领域常规方法进行，例如毛细管吸取技术或有 限稀释法等。 [0014] 本发明中，单细胞可以是动物或人体中任意组织的单细胞，例如从组织中提取的 单细胞、循环肿瘤细胞、循环胎儿细胞等。本发明方法的使用不因单细胞类型不同而受到限 制。 [0015] 一些实施方案中，步骤2)中，Tn5转座酶的用量还可以是例如0.5ng、0.6ng、0.7ng、 0.8ng、0.9ng、1.0ng、1.5ng、2ng、2.5ng、3ng、3.5ng、4ng、4.5ng和5ng。优选用量为2‑4ng，更 优选3ng。 [0016] 本发明中，通过调整合适的Tn5转座酶用量，可以获得较为均匀的DNA片段，以方便 后续获得准确测序结果。 [0017] 本发明所称的Tn5转座酶，是指执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座 子两端的特异序列，把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点。 [0018] 本发明中，可以使用市售的Tn5转座酶试剂盒作为Tn5转座酶来源、也可使用蛋白 表达等方式生产出来的具有转座功能的Tn5。其中，不同试剂盒可以实现基本相同的效果。 常规使用的市售Tn5转座酶试剂盒中，Tn5转座酶含量约为10μM‑50μM，例如10μM、15μM、20μ M、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM，其中优选20‑30μM，更优选25μM。当使用TTE Mix作为 Tn5转座酶来源时，其用量通常为0.8‑1.6μL，优选1‑1.4μL，更优选1.2μL。 [0019] 本发明中，步骤1)所述裂解可通过加入细胞裂解液进行。在一些实施方案中，细胞 裂解液包括Tris‑HCl，EDTA，MDTT和Protease K。在一些实施方案中，细胞裂解液为20‑ 100mM Tris‑HCl pH 8.0‑8.4，1‑5mM EDTA，5‑20mM DTT和0.1‑1mg/ml Protease K，优选为 60mM Tris‑HCl pH 8.0，2mM EDTA，15mM DTT和0.5mg/ml Protease K。 5 5 CN 114350748 A 说明书 3/9页 [0020] 一些实施方案中，步骤3)中，所使用索引条形码包括N5、N7索引条形码，其为PCR扩 增过程中的一对引物，浓度为5‑20μM，优选为10μM。其中N5的序列为： [0021] 5‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[Ia]TCGTCGGCAGCGTC‑3； [0022] N7的序列为： [0023] 5‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Ib]GTCTCGTGGGCTCGG‑3。 [0024] 其中，Ia和Ib分别代表n个任意碱基的组合； [0025] Ia和Ib是相同的或不同的。 [0026] n 其中，n基于待编码文库个数确定，编码文库个数为4 。即，当n为8时，所编码文库 个数为 8 4 。优选地，n＝6、7、8。 [0027] 向每个细胞的全基因组DNA片段中加入不同的N5、N7，可以给该细胞带上独特的编 码。其中[I]段(即Ia或Ib)的碱基各不相同，构成不同的索引条形码。[I]段序列可以根据样 本数目自行设计不同的序列，以产生足够数目的条形码标记不同的细胞。 [0028] 一些实施方案中，步骤2)中，在获得所述Tn5‑DNA复合物后，通过加入终止液终止 DNA片段化，以获得相对均一的DNA片段。 [0029] 一些实施方案中，通过加入0.01％‑0.05％的SDS，更优选为0.02％的SDS，终止DNA 片段化。 [0030] 在对多个单细胞同时进行测序时，步骤3)中可以给每个单细胞添加不同的索引条 形码，用于精准的获取每个单细胞的基因组信息，以实现一次测序，获得多个单细胞的基因 组信息。 [0031] 一些实施方案中，步骤3)中，所述PCR扩增的程序为70‑75℃1‑5min；95‑98℃10‑ 60s；95‑98℃10‑30s，50‑70℃10‑60s，65‑80℃1‑5min，循环次数为5‑30次，优选为10‑25次， 更优选为20次；70‑75℃3‑10min。 [0032] 本发明中，在优选的PCR扩增程序下，能够进一步提高扩增效率，减小扩增偏差。 [0033] 一些实施方案中，步骤4)中，所述纯化的方法为磁分离、柱纯化等。可以根据不同 测序仪器对所检测DNA片段大小范围的需求，调整纯化后的DNA片段大小，例如为300‑ 500bp，而丢弃大于或小于该范围的片段。因此，在建库过程中所获得的DNA片段大小更均 匀，从而获得更多的有用DNA片段，这会使得最终DNA测序的覆盖率更高，均一性更好，更有 利于CNV和SNV分析。 [0034] 另一方面，本发明提供了另一种单细胞建库方法，其将上文所述的测序步骤1)‑步 骤4)及相关方案集成于数字微流控芯片进行。 [0035] 本发明所述的数字微流控芯片，可以是本领域常规使用用于单细胞分离的数字微 流控芯片。 [0036] 一些优选的实施方案中，所述数字微流控芯片包括试剂储液槽、单细胞分离区、扩 增反应区、产物纯化区中的一个或多个的任意组合。 [0037] 一些实施方案中，所述建库方法包括如下步骤： [0038] 1)利用所述数字微流控芯片亲水位点分选单细胞； [0039] 2)裂解单细胞，释放所述单细胞中的全基因组DNA，所需时间约为1h； [0040] 3)向第1)步裂解后的单细胞组分中加入Tn5转座酶，利用Tn5转座酶将DNA切割为 DNA片段，所需时间约为10min； 6 6 CN 114350748 A 说明书 4/9页 [0041] 其中，所述Tn5转座酶的用量为0.5～5ng，优选2‑4ng，更优选3ng。 [0042] 4)对步骤3)中所得DNA片段进行PCR扩增，所需时间2h，在扩增过程中引入索引条 形码，以为每个单细胞添加细胞条形码，PCR扩增试剂中还包含片段化终止剂液，以终止片 段化； [0043] 5)纯化步骤4)扩增后的DNA片段，并测序建库。 [0044] 任选地，重复步骤1)‑5)，以获取多个单细胞的DNA片段。其中完成步骤2)‑步骤4) 所需时间大致为1h、10min和2h。 [0045] 本发明有益效果 [0046] 1.本发明的单细胞全基因组建库方法，在没有任何预扩增步骤情形下，直接从单 细胞模板DNA构建测序文库，操作简单、耗时短，例如利用Tn5转座酶对DNA进行打断，将其切 割成均匀的DNA片段，该过程仅为10min，加入含不同索引条形码的PCR Mix进行PCR扩增，该 过程耗时小于2小时。 [0047] 2.本发明的PCR扩增程序中，给每个单细胞添加独一无二的索引条形码，之后将所 获得的基因组文库进行混库测序，可以精准的获取每个单细胞的基因组信息，以实现一次 测序，获得多个单细胞的基因组信息。 [0048] 3.本发明的单细胞全基因组建库方法，免去预扩增，以原始DNA模板的片段化产物 为模板，尽管使用了多个PCR循环来整合索引条形码和测序接头，但是所有副本都是可以通 过计算识别和删除的精确重复副本，从而生成单细胞基因组，其中任何正确映射的片段都 是原始模板的唯一表示。因此能够大大降低扩增偏倚，并获得更广泛的测序覆盖率，为CNV 和SNV分析提供了有利的信息。 [0049] 4.将本发明的单细胞全基因组建库方法与数字微流控芯片相整合，能够实现自动 化的测序文库构建，大大缩短了测序的时间、试剂和人力成本。从分离单细胞到上机测序仅 需4小时，每个样本的试剂成本仅为7美元。 附图说明 [0050] 图1实施例1(不含数字微流控芯片分离)和实施2(数字微流控芯片分离)单细胞快 速建库示意图。其中在数字微流控芯片文库制备区是指进行以下步骤的区域：单细胞分离、 裂解，插入Tn5转座酶，条形码标引及PCR扩增；纯化区指对扩增后DNA片段进行纯化的区域。 [0051] 图2实施例2细胞快速建库数字微流控芯片示意图(左)和实物图(右)。 [0052] 图3A实施例2步骤2单细胞分离过程显微镜图。 [0053] 图3B实施例2步骤3单细胞裂解过程显微镜图。 [0054] 图4实施例2及对比例1方法所得测序的CNV分析结果，通过与参考序列号hg19进行 比对，得到全基因组拷贝数。其中bulk为群体细胞分析结果，作为阳性参考样本，rapid‑WGS 为本发明所得到结果，MALBAC、MDA为对比实施例。 具体实施方式 [0055] 实施例1 [0056] 以贴壁细胞人胚肺成纤维细胞MRC‑5(购买于中国科学院典型培养物保藏委员会 细胞库，目录号GNHu41)为模型细胞进行实验。 7 7 CN 114350748 A 说明书 5/9页 [0057] 1.单细胞裂解 [0058] 使用毛细管吸取技术获取MRC‑5单细胞，置于PCR管中，加入1μL裂解液，将PCR管置 于PCR仪上加热裂解。裂解液包含60mM Tris‑HCl pH 8.0，2mM EDTA，15mM DTT和0.5mg/ml Protease K，裂解程序为50℃，1h、80℃10min。 [0059] 2.基因组片段化 [0060] 使用 DNA Library Prep Kit V2for (TD503‑01/02)试剂盒， 配制Tn5转座酶混合物，如表1所示。往PCR中加入2μL Tn5转座酶混合物，其中，5×TBBL为 Tn5转座酶缓冲液，TTE Mix：Tn5转座酶。在PCR仪上运行程序：55℃，10min。 [0061] 表1.Tn5转座酶混合物组分 [0062] 成分 用量 5×TBBL 0.8μL TTEMix 1.2μL [0063] 3.PCR扩增 [0064] 使用 DNA Library Prep Kit V2for (TD503‑01/02)和 Index Kit V2 for (TD202)试剂盒，配制PCR Mix，如表2所示。每个样 本加入不同的索引条形码(index)，即不同的N5和N7，以获得单个细胞的基因组信息。加入6 μLPCR Mix，将PCR管置于PCR仪中，运行程序(表3)。 [0065] 其中， [0066] N5序列为： [0067] 样本1: [0068] 5‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[TAGATCGC]TCGTCGGCAGCGTC‑3； [0069] 样本2: [0070] 5‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[CTCTCTAT]TCGTCGGCAGCGTC‑3； [0071] 样本3: [0072] 5‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[AGAGTAGA]TCGTCGGCAGCGTC‑3′； [0073] N7序列为： [0074] 样本1: [0075] 5‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[TAAGGCGA]GTCTCGTGGGCTCGG‑3； [0076] 样本2: [0077] 5‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[CGTACTAG]GTCTCGTGGGCTCGG‑3； [0078] 样本3: [0079] 5‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[AGGCAGAA]GTCTCGTGGGCTCGG‑3； [0080] 表2.PCR Mix组分 [0081] 成分 用量 5×TS 1μL 5×TAB 2μL N5 0.5μL N7 0.5μL 8 8 CN 114350748 A 说明书 6/9页 H O 1.8μL 2 TAB 0.2μL 总体积 6μL [0082] 表3.PCR程序 [0083] [0084] 4.重复上述1‑3步骤，共获得3组平行样本数据。 [0085] 5.通过IlluminaNovaseq测序平台，获得3G数据。测序结果显示，测序基因组覆盖 率平均值为33.02％±6.90％，CV平均值为0.373±0.007。 [0086] 其中，覆盖率是指测序获得的序列占整个基因组的比例。覆盖率低说明测序最终 拼接组装获得的序列不能够覆盖所有的区域，部分基因信息丢失，从而使CNV分析不准确。 CV过高说明数据不均匀，噪声大，会掩盖一些突变。 [0087] 本实施例上述结果说明本发明的建库方法明显提高基因组覆盖度，降低CV值，提 高数据产出质量。 [0088] 实施例2 [0089] 本实施例包括分离单细胞、单细胞裂解、基因组片段化及全基因组扩增反应。具体 的，首先利用数字微流控芯片上分离单细胞；之后加入细胞裂解液裂解单细胞；然后加入 Tn5转座酶混合物利用Tn5转座酶对DNA进行片段化；最后加入含不同索引条形码和片段化 终止液的的PCR Mix进行PCR扩增。扩增产物可直接纯化测序。 [0090] 在实验过程中使用贴壁细胞MRC‑5为模型细胞进行单细胞直接建库。具体的实验 步骤及结果如下： [0091] 1.DMF芯片设计及制作： [0092] 本实施例中可使用本领域已知的数字微流控芯片，例如参见Ruan et al., Sci.Adv.2020；6:eabd6454；Anal.Chem.2020,92,8599‑8606中所示数字微流控芯片。 [0093] 作为示例，设计能够集成单细胞直接片段化建库的流程。如图2所示。芯片为63mm ×63mm的石英玻璃，其包含40个大小为2.2mm×2.2mm的电极，以及8个大小为3.6mm×5.4mm 的储液槽。所述芯片主要包含三个功能分区，包括：储液槽、单细胞分离区、扩增反应区和产 物纯化区。 [0094] 2.分选单细胞： [0095] 使用贴壁细胞人胚肺成纤维细胞MRC‑5(购买于中国科学院典型培养物保藏委员 会细胞库，目录号GNHu41)为模型细胞进行实验。用1×PBS清洗细胞，之后稀释细胞至每微 升含10个左右的单细胞。加入1μL细胞于数字微流控芯片上，操控液滴，在单细胞分离区分 9 9 CN 114350748 A 说明书 7/9页 离单细胞(图3.A)。 [0096] 3.裂解单细胞： [0097] 向芯片上加入1μL裂解液，将芯片置于平板PCR仪上。裂解液包含60mM Tris‑HCl pH 8.0，2mM EDTA，15mMDTT和0.5mg/ml Protease K，裂解程序为55℃，1h)，80℃10min。 [0098] 4.基因组片段化 [0099] 使用 DNA Library Prep Kit V2for (TD503‑01/02)试剂盒， 配制Tn5转座酶混合物，如表1所示。往PCR中加入2μLTn5转座酶混合物，其中，TBBL为Tn5转 座酶缓冲液，TTE Mix：Tn5转座酶，在PCR仪上运行程序：55℃，10min。 [0100] 表4.Tn5转座酶混合物组分 [0101] 成分 用量 5×TBBL 0.8μL TTEMix 1.2μL 总体积 2.0μL [0102] 3.PCR扩增 [0103] 使用 DNA Library Prep Kit V2for (TD503‑01/02)和 Index Kit V2 for (TD202)试剂盒，配制PCR Mix，如表2所示。每个样 本加入不同的条形码(index)，即不同的N5和N7，以获得单个细胞的基因组信息。加入6μ LPCR Mix，将PCR管置于PCR仪中，运行程序(表5)。 [0104] 其中， [0105] N5序列为： [0106] 样本1: [0107] 5‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[TAGACCGC]TCGTCGGCAGCGTC‑3； [0108] 样本2: [0109] 5‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[CTCTAGCT]TCGTCGGCAGCGTC‑3； [0110] 样本3: [0111] 5‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[AGAGTTAA]TCGTCGGCAGCGTC‑3； [0112] N7序列为： [0113] 样本1: [0114] 5‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[TAAGGAGA]GTCTCGTGGGCTCGG‑3； [0115] 样本2: [0116] 5‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[CGTACAAG]GTCTCGTGGGCTCGG‑3； [0117] 样本3: [0118] 5‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[AGGCATAA]GTCTCGTGGGCTCGG‑3； [0119] 表5.PCR Mix组分 [0120] 成分 用量 2×TS 1μL 5×TAB 2μL N5 0.5μL 10 10 CN 114350748 A 说明书 8/9页 N7 0.5μL H O 1.8μL 2 TAB 0.2μL 总体积 6μL [0121] 表6.PCR程序 [0122] [0123] 6.重复上述1‑3步骤，共获得3组平行样本数据。 [0124] 7.通过IlluminaNovaseq测序平台，获得3G数据。测序结果显示，测序基因组覆盖 率平均值为35.60％±6.00％，CV平均值为0.386±0.074。说明本发明能够明显提高基因组 覆盖度，降低CV值，提高数据产出质量。CNV分析(如图4所示)表明，我们的方法得到的拷贝 数结果更为均匀，能够准确检测出拷贝数变异。 [0125] 对比例1 [0126] 采用本领域已知全基因组扩增法MDA及MALBAC，在单细胞文库构建前，对单细胞基 因组进行预扩增，继而进行测序。 [0127] MDA及MALBAC的具体实验步骤如下所示： [0128] 1)MALBAC的具体实验步骤： [0129] 通过显微镜实现细胞的挑取，收集在0.2ml无RNase的Eppendorf管中，转移试剂控 制在1微升以内，利用商品化的全基因组扩增试剂盒 单细胞全基因组扩增试剂 盒(上海亿康医学检验所有限公司)进行后续操作。细胞扩增后采用磁珠(南京诺唯赞生物 科技有限公司，货号N412‑01)对产物进行纯化。对所获基因组进行全基因组建库(南京诺唯 赞生物科技有限公司，货号TD502‑01)，采用磁珠(参考南京诺唯赞生物科技有限公司，货号 N412‑01)纯化对产物进行纯化。定量后，使用二代全基因组测序分析NovaSeq技术 (Illumina)进行测序分析(北京诺禾致源科技股份有限公司)。通过与参考基因组序列hg19 (hg19数据来源于网站中收录的人全基因组的序列信息)进行比 对，得到细胞的全基因组拷贝数。 [0130] 2)MDA的具体实验步骤： [0131] 通过显微镜实现细胞的挑取，收集在0.2ml无RNase的Eppendorf管中，转移试剂控 制在1μL以内，利用商品化的全基因组扩增试剂盒Qiagen 150343REPLI‑g Single Cell Kit(德国凯杰(QIAgen)生物公司)进行后续操作。细胞扩增后采用磁珠(南京诺唯赞生物科 技有限公司，货号N412‑01)对产物进行纯化。对所获基因组进行全基因组建库(南京诺唯赞 生物科技有限公司，货号TD502‑01)，采用磁珠(参考南京诺唯赞生物科技有限公司，货号 11 11 CN 114350748 A 说明书 9/9页 N412‑01)纯化对产物进行纯化。定量后，使用二代全基因组测序分析NovaSeq技术 (Illumina)进行测序分析(北京诺禾致源科技股份有限公司)。通过与参考基因组序列hg19 进行比对，得到细胞的全基因组拷贝数。 [0132] 最终测序结果如表7所示 [0133] 表7 [0134] [0135] 根据上述数据可知，通过传统MALBAC和MDA法进行预扩增之后建库得到的单细胞 基因组覆盖率较低、CV值较高。基因组覆盖率越低，CV越高说明获取的数据质量越差，会导 致对拷贝数变异进行检测的CNV和对单个碱基进行检测的SNV分析结果产生偏差。越差的数 据，越容易掩盖这些突变，导致无法检出。 [0136] 基于本发明实施例与对比例效果比较(如图4所示)，可见需进行预扩增步骤的传 统方法MALBAC和MDA测得数据不均匀，容易掩盖拷贝数变异，其测序效果数据远不及本发明 方法。本发明得到的拷贝数结果更为均匀，所得高覆盖率和低CV值，有助于进一步的CNV和 SNV监测，更为准确地检测单细胞序列。 12 12 CN 114350748 A 序列表 1/2页 序列表 110 厦门大学 120 一种快速单细胞建库方法 160 12 170 SIPOSequenceListing 1.0 210 1 211 51 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 1 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgctcg tcggcagcgt c 51 210 2 211 51 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 2 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctattcg tcggcagcgt c 51 210 3 211 51 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 3 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gagtagatcg tcggcagcgt c 51 210 4 211 47 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 4 caagcagaag acggcatacg agattaaggc gagtctcgtg ggctcgg 47 210 5 211 47 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 5 caagcagaag acggcatacg agatcgtact aggtctcgtg ggctcgg 47 210 6 211 47 212 DNA 13 13 CN 114350748 A 序列表 2/2页 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 6 caagcagaag acggcatacg agataggcag aagtctcgtg ggctcgg 47 210 7 211 51 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 7 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agaccgctcg tcggcagcgt c 51 210 8 211 51 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 8 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctagcttcg tcggcagcgt c 51 210 9 211 51 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 9 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gagttaatcg tcggcagcgt c 51 210 10 211 47 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 10 caagcagaag acggcatacg agattaagga gagtctcgtg ggctcgg 47 210 11 211 47 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 11 caagcagaag acggcatacg agatcgtaca aggtctcgtg ggctcgg 47 210 12 211 47 212 DNA 213 人工序列(Artificial Sequence) 400 12 caagcagaag acggcatacg agataggcat aagtctcgtg ggctcgg 47 14 14 CN 114350748 A 说明书附图 1/2页 图1 图2 15 15 CN 114350748 A 说明书附图 2/2页 图3 图4 16 16
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