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一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法pdf
本发明公开了一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法。该方法包括：一次采集人外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心法获得外周血单个核细胞；一部分细胞直接冻存，另一部分细胞，通过流式细胞仪分选出CD3+淋巴细胞，进行CIK细胞扩增培养，编码冻存；分选出CD3+淋巴细胞后的剩余细胞，通过流式细胞仪分选出CD56+淋巴细胞，进行NK细胞扩增培养，编码冻存；分选出CD56+淋巴细胞后的剩余细胞，通过流式细胞仪分选出CD34‑细胞进行MSC细胞培养，再编码冻存。该方法一次采集外周血，分离单个核细胞，可以
(19)国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 114807031 A (43)申请公布日 2022.07.29 (21)申请号 9.3 A01N 1/02 (2006.01) C40B 50/06 (2006.01) (22)申请日 2022.05.13 (71)申请人 山东赛恩福干细胞工程集团有限公 司 地址 250000 山东省济南市中国（山东）自 由贸易试验区济南片区港兴三路1号 创业服务中心2号楼1708 (72)发明人 陈莉邓长江尚现岗李春娜 夏冬梅王范 (74)专利代理机构 济南诚智商标专利事务所有 限公司 37105 专利代理师 韩百翠 (51)Int.Cl. C12N 5/0783 (2010.01) C12N 5/0775 (2010.01) 权利要求书2页 说明书7页 附图3页 (54)发明名称 一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构 建方法 (57)摘要 本发明公开了一种人外周血免疫细胞库和 干细胞库的构建方法。该方法包括：一次采集人 外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心法获 得外周血单个核细胞；一部分细胞直接冻存，另 + 一部分细胞，通过流式细胞仪分选出CD3 淋巴细 胞，进行CIK细胞扩增培养，编码冻存；分选出 + CD3 淋巴细胞后的剩余细胞，通过流式细胞仪分 + 选出CD56 淋巴细胞，进行NK细胞扩增培养，编码 + 冻存；分选出CD56 淋巴细胞后的剩余细胞，通过 ‑ 流式细胞仪分选出CD34 细胞进行MSC细胞培养， 再编码冻存。该方法一次采集外周血，分离单个 A 核细胞，可以同时分离NK细胞、CIK细胞和MSC细 1 胞，满足多种需求，避免了多次采血的问题。 3 0 7 0 8 4 1 1 N C CN 114807031 A 权利要求书 1/2页 1.一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，包括以下步骤： S1：一次采集人外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心法获得外周血单个核细胞； 一部分细胞直接冻存； + S2：步骤S1除冻存以外的另一部分细胞，通过流式细胞仪分选出CD3淋巴细胞，进行CIK 细胞扩增培养，编码冻存； + + S3：步骤S2分选出CD3 淋巴细胞后的剩余细胞，通过流式细胞仪分选出CD56 淋巴细胞， 进行NK细胞扩增培养，编码冻存； + ‑ S4：步骤S3分选出CD56 淋巴细胞后的剩余细胞，通过流式细胞仪分选出CD34 细胞进行 MSC细胞培养，再编码冻存。 2.如权利要求1所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所 述步骤S1的一次采集人外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心法获得外周血单个核细 胞，具体为： 1)将肝素钠采血管中的外周血转入离心管中，离心；离心完毕后，将上层血浆制备成自 体血浆备用； 2)离心后的下层外周血加入生理盐水吹打混匀，然后加入到淋巴细胞分离液中，再次 离心； 3)取离心管中间白膜层细胞加生理盐水颠倒混匀，离心，弃上清，再重复1‑3次，沉淀即 为外周血PBMC。 3.如权利要求1所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所 述步骤S1的部分细胞直接冻存为：将部分外周血PBMC加入免疫细胞冻存液重悬细胞进行冻 6 存，细胞密度为2～3×10个/mL；所述免疫细胞冻存液按体积份数，其成分为：1～5％的自 体血浆，10％的DMSO，10％的6％右旋糖酐‑40葡萄糖注射液，75％～79％的羟乙基淀粉，总 量100％。 4.如权利要求1所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所 述步骤S2进行CIK细胞扩增培养为： + 1)分选后的CD3细胞中加入KBM581或X‑VIVO15培养基重悬，加入INF‑γ，置于培养箱中 培养； 2)第2天，加入IL‑2和CD3 Ab，继续培养；第4‑5天，补加完全培养基， 6 3)第6天，计数，如果细胞密度达到1～2×10 ，将所有细胞转到细胞培养袋中，补加完全 培养基，然后第8～10天，继续补加完全培养基； 4)第14天，离心，弃掉上清液，加入生理盐水清洗，收集CIK细胞。 5.如权利要求4所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所 述加入的INF‑γ终浓度100～1000IU/mL，IL‑2终浓度1000±200IU/mL、CD3 Ab的终浓度20 ～200ng/mL；所述完全培养基为：含1000±200IU/mL IL‑2的KBM581或X‑VIVO15培养基。 6.如权利要求1所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所 述步骤S3进行NK细胞扩增培养为： + 1)分选出的CD56细胞，加入KBM581或X‑VIVO15培养基重悬，添加IL‑2、IL‑21和IL‑15刺 激NK细胞活化并扩增； 2)前3天细胞放在培养箱中，不要移动；第4天继续添加KBM581或X‑VIVO15培养基和细 2 2 CN 114807031 A 权利要求书 2/2页 胞因子IL‑2、IL‑21、IL‑15进行培养； 6 2)第6天，计数，如果细胞密度达到1～2×10 ，将所有细胞转到细胞培养袋中，补加 KBM581或X‑VIVO15培养基和细胞因子IL‑2、IL‑21、IL‑15；然后第8～10天，补加继续补加 KBM581或X‑VIVO15培养基和细胞因子IL‑2、IL‑21、IL‑15； 4)第14天，离心，弃掉上清液，加入生理盐水清洗，收集NK细胞。 7.如权利要求6所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所 述IL‑2终浓度1000±200IU/mL，IL‑21终浓度100‑1000IU/mL，IL‑15的终浓度10～500ng/ mL。 8.如权利要求4或6所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征 7 是，所述步骤S2、S3的冻存入库为：加入免疫细胞冻存液，调整细胞密度为2～3×10个/mL； 所述免疫细胞冻存液按体积比计，其成分为：1～5％的自体血浆，10％的DMSO，10％的6％右 旋糖酐‑40葡萄糖注射液，75％～79％的KBM581培养基，总量100％。 9.如权利要求1所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是，所 述步骤S4的MSC细胞培养具体为： ‑ 1)分选出CD34细胞用无血清培养基调整细胞密度，培养箱中培养； 2)第2天，换液去除漂浮细胞，加入新鲜无血清培养基，继续培养5‑7天，细胞生长达80 ～90％融合时，胰酶消化法获得MSC细胞。 10.如权利要求9所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征是， 所述无血清培养基为：含2～200ng/mL VEGF、2～200ng/mL PDGF、0.1～10μg/mL EGF、1～ 100μg/ml重组人胰岛素、5～50μg/ml转铁蛋白的α‑MEM培养基。 11.如权利要求9或10所述的一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征 7 是，步骤S4的冻存为：加入冻存液冻存细胞，冻存密度为0.5～1×10个/mL，冻存入库，冻存 液按体积比计，其成分为：10％的DMSO，20％血小板裂解物，70％α‑MEM培养基。 3 3 CN 114807031 A 说明书 1/7页 一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法 技术领域 [0001] 本发明涉及一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，属于细胞培养和细 胞库构建领域。 背景技术 [0002] 细胞治疗是指获取人自体或异体来源的具有特定功能的活细胞，经体外分离、纯 化、培养、扩增、冻存、复苏、质检合格后，回输入人体，起到治疗疾病和抗衰老的作用。根据 细胞类型，细胞治疗可分为干细胞治疗、免疫细胞治疗和体细胞治疗等。 [0003] 从1960年，老鼠骨髓中的不断增殖及可分化的造血干细胞的发现，人们渐渐认识 到干细胞的存在，到英国科学家在1997年克隆出多利羊，意识到干细胞的再生作用，再到山 中伸弥利用体细胞成功诱导出多能干细胞(iPSC)，50年的时间内，干细胞技术发展迅速，人 们开始希望能够通过干细胞来治疗各类重大疾病以及再生各种组织器官。随着2012年诺贝 尔医学奖颁给诱导多能干细胞(iPSC)，干细胞的潜在医学应用在世界各国得到了更为广泛 的重视，而随着中国老龄化进程的加快，利用存储的干细胞进行个体化治疗的前景也越来 越接近现实。干细胞治疗是再生医学革命最先进的临床治疗技术，该技术是指通过对干细 胞进行分离、体外培养、定向诱导、甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至 更年轻的细胞、组织或器官，并最终通过细胞组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。免 疫治疗就是指基于免疫学的原理与方法，采集人体外周血或脐血等来源的免疫细胞，进行 体外大规模培养扩增，以增强靶向性杀伤功能，再回输入人体内，通过调动人体免疫系统杀 伤血液与组织中的病原体、癌细胞及突变细胞，抑制肿瘤生长，增强机体免疫力。现在临床 应用较多的免疫细胞包括CIK细胞、NK细胞、NKT细胞等。 [0004] 细胞冻存是细胞长期保存最有效的方法之一。每个人都有属于自己独特的细胞， 如果在年轻健康时，将优质的细胞提前冻存在‑196℃的深低温液氮罐中，就可以让细胞停 止老化，永久保持在最年轻、最有活力的状态。将来一旦身体需要，就可利用提前储备的种 子细胞培养出更多优质的细胞，用于提高机体免疫力，改善/增强身体状况、抵抗癌症，甚至 挽救生命。为了方便储存各种细胞资源，目前全世界范围内已经建立多家细胞库或生物样 本库，包括脐带血库，脐带间充质干细胞库，免疫细胞库等。 [0005] 外周血是免疫细胞和干细胞的重要来源之一，在一定的诱导条件下可以扩增培养 NK(natural killer cell，自然杀伤细胞)、CIK(cytokine‑induced killer，细胞因子诱导 的杀伤细胞)和iPSC(induced pluripotent stem cells，诱导性多能干细胞)等细胞。收集 8 100mL人体外周血，一般可分离得到0.6‑1.5×10 的单个核细胞，目前通过文献和专利检 索，发现多数方法也是直接将外周血单个核细胞冻存，待使用时复苏单个核细胞再进行培 养，这种方法培养的CIK细胞、NK细胞等扩增效率低，细胞杀伤活力较差，无法满足临床需 要。而且，冻存的外周血单个核细胞复苏后得率大概只有50％，数量只够一种细胞比如扩增 培养CIK细胞使用，很多时候还需要面临二次采血、三次采血的问题。因此，急需要一种新的 方法，一次采血，就可以实现不同种类细胞包括干细胞和免疫细胞的冻存需求，不需要多次 4 4 CN 114807031 A 说明书 2/7页 采血，同时分别冻存干细胞和免疫细胞，以后可针对不同疾病的治疗，干细胞可用于慢性疾 病包括糖尿病、肝病、心脑血管疾病、神经系统疾病的治疗，免疫细胞可用于肿瘤治疗、提升 免疫力、亚健康调理等。 发明内容 [0006] 为了解决上述现有技术存在的不足，本发明提供了一种人外周血免疫细胞库和干 细胞库的构建方法，本发明一次采集人外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心法获得 + 单个核细胞，一部分细胞直接冻存；另一部分通过流式细胞仪分选出CD3 细胞，进行CIK细 + + 胞扩增培养；上步分选出CD3 细胞的剩余细胞分选出CD56 细胞进行NK细胞扩增培养；上步 + ‑ 分选出CD56 细胞的剩余细胞通过流式细胞仪分选出CD34 细胞进行MSC细胞(间充质干细 胞)培养，再分别编码冻存。该方法一次采血，就可以实现不同种类细胞包括干细胞和免疫 细胞的冻存需求，避免了多次采血的问题。 [0007] 本发明的技术方案是：一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法，其特征 是，包括以下步骤(如图1所示)： [0008] S1：一次采集人外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心法获得外周血单个核 细胞；一部分细胞直接冻存； [0009] + S2：步骤S1除冻存以外的另一部分细胞，通过流式细胞仪分选出CD3 淋巴细胞，进 行CIK细胞扩增培养，编码冻存； [0010] + + S3：步骤S2分选出CD3 淋巴细胞后的剩余细胞，通过流式细胞仪分选出CD56 淋巴 细胞，进行NK细胞扩增培养，编码冻存； [0011] + ‑ S4：步骤S3分选出CD56 淋巴细胞后的剩余细胞，通过流式细胞仪分选出CD34 细胞 进行MSC细胞培养，再编码冻存。 [0012] 进一步的，所述步骤S1的一次采集人外周血，采用密度梯度离心法结合差速离心 法获得外周血单个核细胞，具体为： [0013] 1)将肝素钠采血管中的外周血转入离心管中，离心；离心完毕后，将上层血浆制备 成自体血浆备用； [0014] 2)离心后的下层外周血加入生理盐水吹打混匀，然后加入到淋巴细胞分离液中， 再次离心； [0015] 3)取离心管中间白膜层细胞加生理盐水颠倒混匀，离心，弃上清，再重复1‑3次(加 生理盐水颠倒混匀，离心，弃上清)，沉淀即为外周血PBMC。 [0016] 进一步的，所述步骤S1的部分细胞直接冻存为：将外周血PBMC加入免疫细胞冻存 6 液重悬细胞进行冻存，细胞密度为2～3×10个/mL。免疫细胞冻存液配方为：按体积份数， 包括以下成分：1～5％的自体血浆，10％的DMSO，10％的右旋糖酐40(6％右旋糖酐‑40葡萄 糖注射液)，75％～79％的羟乙基淀粉(胶体溶液)，总量100％。 [0017] 进一步的，所述步骤S2进行CIK细胞扩增培养为： [0018] + 1)分选后的CD3细胞中加入KBM581或X‑VIVO15培养基重悬，加入INF‑γ，置于培 养箱中培养； [0019] 2)第2天，加入IL‑2和CD3 Ab，继续培养；第4‑5天，补加完全培养基， [0020] 6 3)第6天，计数，如果细胞密度达到1～2×10 ，将所有细胞转到细胞培养袋中，补 5 5 CN 114807031 A 说明书 3/7页 加完全培养基，然后第8～10天，继续补加完全培养基； [0021] 4)第14天，离心，弃掉上清液，加入生理盐水清洗，收集CIK细胞。 [0022] 上述加入的INF‑γ终浓度100～1000IU/mL，IL‑2终浓度1000±200IU/mL、CD3 Ab 的终浓度20～200ng/mL。 [0023] 其中，完全培养基为：含1000±200IU/mL IL‑2的KBM581或X‑VIVO15培养基。 [0024] 进一步的，所述步骤S3进行NK细胞扩增培养为： [0025] + 1)分选出的CD56细胞，加入KBM581或X‑VIVO15培养基重悬，添加IL‑2、IL‑21和 IL‑15刺激NK细胞活化并扩增； [0026] 2)前3天细胞放在培养箱中，不要移动；第4天继续添加KBM581或X‑VIVO15培养基 和细胞因子IL‑2、IL‑21、IL‑15进行培养； [0027] 6 2)第6天，计数，如果细胞密度达到1～2×10 ，将所有细胞转到细胞培养袋中，补 加KBM581或X‑VIVO15培养基和细胞因子IL‑2、IL‑21、IL‑15；然后第8～10天，补加继续补加 KBM581或X‑VIVO15培养基和细胞因子IL‑2、IL‑21、IL‑15； [0028] 4)第14天，离心，弃掉上清液，加入生理盐水清洗，收集NK细胞。 [0029] 进一步的，上述使用的IL‑2终浓度1000±200IU/mL，IL‑21终浓度100‑1000IU/mL， IL‑15的终浓度10～500ng/mL。 [0030] 进一步的，所述步骤S2、S3的冻存入库为：加入免疫细胞冻存液，调整细胞密度为2 7 ～3×10个/mL。免疫细胞冻存液配方为：按体积份数包括以下成分：1～5％的自体血浆， 10％的DMSO，10％的右旋糖酐40(6％右旋糖酐‑40葡萄糖注射液)，75％～79％的KBM581培 养基，总量100％。 [0031] 进一步的，步骤S4的MSC细胞培养具体为： [0032] ‑ 1)分选出CD34细胞用无血清培养基调整细胞密度，培养箱中培养； [0033] 2)第2天，换液去除漂浮细胞，加入新鲜无血清培养基，继续培养5‑7天，细胞生长 达80～90％融合时，胰酶消化法获得MSC细胞。 [0034] 进一步的，所述无血清培养基为含2～200ng/mL VEGF(细胞生长因子)、2～200ng/ mL PDGF(生长因子)、0.1～10μg/mL EGF(表皮生长因子)、1～100μg/ml重组人胰岛素、5～ 50μg/ml转铁蛋白的α‑MEM培养基。 [0035] 7 进一步的，步骤S4的冻存为：加入冻存液冻存细胞，冻存密度为0.5～1×10 个/ mL，冻存入库，冻存液配方(按体积比计)为：10％的DMSO，20％血小板裂解物，70％α‑MEM培 养基。 [0036] 本发明方法的优点： [0037] 1.一次采集外周血100mL，分离单个核细胞，可以同时扩增培养NK细胞、CIK细胞和 MSC细胞，满足多种需求。 [0038] + + 2.采用流式细胞仪分选CD3 细胞培养CIK，CD56 细胞培养NK细胞，CIK细胞纯度CD3 + + ‑ + CD56 可达到85％以上，NK细胞纯度CD3 CD56 可达到90％以上，较传统方法更高；细胞增殖 更快：14天细胞可增殖近1000倍。 [0039] ‑ 3.采用流式细胞仪分选CD34 细胞培养MSC细胞，细胞增殖更快，纯度可达98％以 上。 [0040] 4.培养过程和冻存中使用的试剂全部不含动物来源的牛血清，人血白蛋白等；使 6 6 CN 114807031 A 说明书 4/7页 用的血浆来自客户自体外周血分离的血浆。 附图说明 [0041] 图1为本发明一次采集外周血分离NK细胞、CIK细胞和MSC细胞构建细胞库的流程 图； [0042] 图2为倒置显微镜下观察经流式分选的PBMC诱导培养的CIK细胞形态图：A为诱导 后第3天(×40倍)；B为诱导后第5天(×40倍)；C为诱导后第6天(×40倍)； [0043] 图3为倒置显微镜下观察经流式分选的PBMC诱导培养的NK细胞形态图：A为诱导后 第4天(×40倍)；B为诱导后第7天(×40倍)； [0044] 图4是倒置显微镜下观察经流式分选的PBMC诱导培养的MSC细胞形态图：A为传代 后第1天(×40倍)；B为传代后第2天(×40倍)； [0045] 图5是流式细胞仪检测经流式分选的脐血间充质干细胞的细胞表型。 具体实施方式 [0046] 以下结合实施例和说明书附图1的一次采集外周血分离NK细胞、CIK细胞和MSC细 胞构建细胞库的流程图，来对本发明的方案进行详细说明。单词注释：PBMC：外周血单个核 细胞；IL‑2：白细胞介素2；IL‑15：白细胞介素15；IL‑21：白细胞介素21；CD3 Ab：CD3单克隆 抗体；INF‑γ：干扰素γ；MSC：间充质干细胞；NK：自然杀伤细胞；CIK：细胞因子诱导的杀伤 细胞；CD3‑PE：PE标记的CD3单克隆抗体；CD56‑FITC：FITC标记的CD56单克隆抗体。 [0047] 实施例1： [0048] 一、单个核细胞分离及冻存入库 [0049] 1.将肝素钠采血管中的外周血转入50mL离心管中，低温冷冻离心机4℃，1500rpm， 离心10分钟，升9降3(升速9档，降速3档，下同)； [0050] 2.离心完毕后，将上层血浆转入50mL离心管中，56℃水浴30分钟，4℃，3000rpm离 心10分钟，升9降9，收集上清液‑20℃保存，作为自体血浆备用； [0051] 3.第2步剩下的外周血(收集上清液后剩余的部分)中按体积比1:1加入生理盐水 稀释，吹打混匀； [0052] 4.将第3步中混匀稀释的外周血，缓慢加到备好的1.077g/mL淋巴细胞分离液 (15mL/管，厂家GE，货号17‑5442‑02)的离心管上层，每支加30mL； [0053] 5.低温冷冻离心机1800～2500rpm/min离心20min，升7降3，温度为20℃； [0054] 6.取离心管中间白膜层细胞至一新的50mL离心管中，加生理盐水至50mL，颠倒混 匀，1800rpm/min，离心10min； [0055] 7.弃掉上清，加生理盐水至50mL，重悬细胞，1600rpm/min，离心8min； [0056] 8.弃掉上清，加生理盐水至50mL，重悬细胞，混匀后取0.5mL细胞悬液计数， 1200rpm/min，离心8min。弃上清，沉淀即为外周血PBMC；一部分质检合格(质检标准：无菌、 8 无支原体、内毒素≤0.25EU/mL，细胞数≥1×10个)后进行下述步骤9的冻存入库；另一部 分进行流式细胞仪分选，依次进行如下二、三和四的操作； [0057] 6 9.冻存入库：加入免疫细胞冻存液重悬细胞，细胞密度为2～3×10个/mL。冻存液 配方为：按体积分数，包括以下成分：1～5％的自体血浆，10％的DMSO，10％的右旋糖酐40 7 7 CN 114807031 A 说明书 5/7页 (6％右旋糖酐‑40葡萄糖注射液)，75％～79％的羟乙基淀粉(胶体溶液)，总量100％。 [0058] 二、CIK细胞培养及冻存入库 [0059] + 1.采用流式细胞仪将PBMC细胞中的CD3 细胞分选出来； [0060] + 7 2.分选后的CD3 细胞中，取出3×10个细胞，加入30mL KBM581或X‑VIVO15培养基 重悬，加入INF‑γ(终浓度500～1000IU/mL)，置于37℃、5％CO培养箱中培养； 2 [0061] 3.第2天，加入IL‑2(终浓度1000IU/mL)、CD3 Ab(终浓度50～200ng/mL)，继续培 养； [0062] 4.第4天，补加30mL完全培养基，其中完全培养基为：含1000IU/mL IL‑2的KBM581 或X‑VIVO15培养基； [0063] 5.第5天，补加90mL完全培养基； [0064] 6 6.第6天，计数，如果细胞密度达到1～2×10 ，将所有细胞转到细胞培养袋中，补 加450ml完全培养基； [0065] 7.第8～10天，继续补加1200mL完全培养基(3天一共1200ml)； [0066] 8.第11天，取样检测细菌、真菌和支原体(质控标准：无细菌真菌、无支原体感染)； [0067] 9.第14天，2000rpm离心5min，弃掉上清液，收集细胞，加入0.9％生理盐水洗三次， 2000rpm离心5min； [0068] 7 10.冻存入库：弃掉上清液，加入免疫细胞冻存液，细胞密度为2～3×10个/mL。冻 存液配方为：按体积分数包括以下成分：1～5％的自体血浆，10％的DMSO，10％的右旋糖酐 40(6％右旋糖酐‑40葡萄糖注射液)，75％～79％的KBM581培养基，总量100％。 [0069] 本实施例倒置显微镜下观察经流式分选的PBMC诱导培养的CIK细胞形态图如图2 所示，其中A为诱导后第3天(×40倍)；B为诱导后第5天(×40倍)；C为诱导后第6天(×40 倍)，从图2中可以看出：CIK细胞增殖速度较快，第3天细胞呈悬浮状态，第5天细胞开始聚集 成团，第6天细胞增殖迅速，细胞团明显增多。 [0070] 三、NK细胞培养及冻存入库 [0071] 1.包被培养瓶：向T75培养瓶中加入重组抗人CD16单克隆抗体(5～50μg/mL)，37℃ 放置1h或保存在4℃，过夜； [0072] + 7 2.通过流式细胞仪分选出CD56 细胞，取出2×10个细胞，加入20mL KBM581或X‑ VIVO15培养基重悬，移入到包被好的T75培养瓶中，添加IL‑2(终浓度1000IU/mL)、IL‑21(终 浓度100‑1000IU/mL)、IL‑15(终浓度50～500ng/mL)刺激NK细胞活化并扩增；前3天细胞放 在37℃、5％CO 培养箱中，不要移动； 2 [0073] 3.第4天，继续添加KBM581或X‑VIVO15培养基40mL和细胞因子IL‑2(终浓度 1000IU/mL)、IL‑21(终浓度100‑1000IU/mL)、IL‑15(终浓度10～100ng/mL)； [0074] 6 4.第6天，计数，如果细胞密度达到1～2×10 ，将所有细胞转到细胞培养袋中，补 加300mL KBM581或X‑VIVO15培养基和细胞因子IL‑2(终浓度1000IU/mL)、IL‑21(终浓度 100‑1000IU/mL)、IL‑15(终浓度50～500ng/mL)； [0075] 5.第8～10天，继续补加1200mL KBM581或X‑VIVO15培养基(3天一共1200ml)和细 胞因子IL‑2(终浓度1000IU/mL)、IL‑21(终浓度100‑1000IU/mL)、IL‑15(终浓度50～500ng/ mL)； [0076] 6.第11天，取样检测细菌、真菌和支原体(质控标准：无细菌真菌、无支原体感染)； 8 8 CN 114807031 A 说明书 6/7页 [0077] 7.第14天，2000rpm离心5min，弃掉上清液，加入0.9％生理盐水洗两次，取样计数， 2000rpm离心5min，弃掉上清液，收集NK细胞； [0078] 6 8.流式细胞仪检测细胞表型：取第7步收获的NK细胞(细胞总数为5×10)于50mL 离心管中，补充生理盐水至50mL，2000rpm离心5min，弃上清液，加500μL生理盐水重悬细胞， 分装100μL/EP管，5管，加入10μL CD3‑PE/CD56‑FITC单克隆抗体，1管中加入10μL CD3‑PE，1 管中加入10μL CD56‑FITC，1管加入同型对照，一管作为空白对照，混匀，37℃避光孵育 30min。2000rpm离心5min，弃上清，加入1mL/管的生理盐水洗涤细胞2次，2000rpm离心5min， 弃上清，每管加入200μL生理盐水重悬细胞，4℃保存，流式细胞仪上机检测。 [0079] 9.冻存入库：取第7步收获的NK细胞，补充生理盐水至50mL，2000rpm离心5min，弃 7 掉上清液，加入免疫细胞冻存液，细胞密度为2～3×10个/mL。冻存液配方为：按体积分数 包括以下成分：1～5％的自体血浆，10％的DMSO，10％的右旋糖酐40(6％右旋糖酐‑40葡萄 糖注射液)，75％～79％的KBM581培养基。 [0080] 经流式分选的PBMC诱导培养的NK细胞与未分选的PBMSC诱导培养的NK细胞增殖倍 数和细胞表型的对比数据如表1所示，倒置显微镜下观察经流式分选的PBMC诱导培养的NK 细胞形态图如图3所示，其中A为诱导后第4天(×40倍)；B为诱导后第7天(×40倍)。 [0081] 表1：NK细胞增殖倍数和细胞表型的对比数据 [0082] [0083] ‑ + 如表1所示，本发明经PBMC流式分选诱导培养NK细胞纯度CD3 CD56 表达量可达到 90％以上，较未分选PBMC诱导培养的高10％左右，从图3可以看出：培养第4天出现细胞团， 第7天细胞大量扩增，细胞团明显增大。 [0084] 四、MSC细胞培养及冻存入库 [0085] ‑ 1.通过流式细胞仪分选出CD34细胞，用无血清培养基(含20ng/mL VEGF、20ng/mL PDGF、1μg/mL EGF、10μg/ml重组人胰岛素、10μg/ml转铁蛋白的α‑MEM培养基)调整细胞密度 5 为5×10个/mL，接种于T75瓶中(无血清培养基15mL)，放置于37℃、5％CO培养箱中培养； 2 [0086] 2.第2天，换液去除漂浮细胞，加入15mL新鲜无血清培养基，继续培养5‑7天，倒置 显微镜下每天观察细胞形态和融合度； [0087] 3.细胞生长达80～90％融合时进行传代培养，每隔3天传代1次； [0088] 细胞传代具体如下：胰酶消化法收获细胞(细胞生长达80～90％融合时，弃掉培养 液，加入3mL/瓶生理盐水清洗细胞两遍，加入1mL/瓶0.05％胰蛋白酶消化1min，待细胞皱缩 变圆后加入15mL/瓶新鲜培养基终止消化，收集细胞到50mL离心管中，1200rpm离心5min，弃 掉上清液，加入50mL生理盐水重悬细胞，取0.5mL细胞悬液计数，1200rpm离心5min，弃掉上 9 9 CN 114807031 A 说明书 7/7页 2 清液)，然后加入新鲜培养基重悬细胞，按照8000个/cm 的密度接种细胞。 [0089] 4.流式细胞仪检测细胞表型：收集处于对数生长期的P4代MSC细胞(细胞总数为8 6 ×10)于50mL离心管中，1200rpm离心5min，弃上清液，加50mL生理盐水重悬洗两次，离心弃 上清，保留细胞，加800μL生理盐水重悬细胞，分装100μL/EP管，8管，加入10μL PE标记的 CD34，CD45，CD73，CD90，CD105，HLA‑DR和PE‑IgG抗体，另外一管作为空白对照，混匀，37℃避 光孵育30min。1200rpm离心5min，弃上清，加入1mL/EP管的生理盐水洗涤细胞2次，1200rpm 离心5min，弃上清，每管加入200μL生理盐水重悬细胞，4℃保存，流式细胞仪上机检测。流式 细胞仪检测经流式分选的脐血间充质干细胞的细胞表型如图5所示，从图5可以看出：脐血 间充质干细胞高表达CD73，CD90，CD105，阳性率＞99％，低表达CD34，CD45，HLA‑DR，阳性率 ＜0.5％，完全符合间充质干细胞的特征。 [0090] 6.冻存入库：接第2步，细胞生长达80～90％融合时，采用胰酶消化法收获细胞(步 7 骤同第3步)，加入冻存液冻存细胞，冻存密度为0.5～1×10个/mL，冻存入库。冻存液配方 为：10％的DMSO，20％血小板裂解物，70％α‑MEM培养基。 [0091] 本实施例倒置显微镜下观察经流式分选的PBMC诱导培养的MSC细胞形态图如图4 所示，其中A为传代后第1天(×40倍)；B为传代后第2天(×40倍)；如图4所示：倒置显微镜下 可见传代后第2天细胞贴壁生长，形态均一，呈长梭形或纺锤形，符合间充质干细胞的典型 形态，第3天细胞增殖迅速，融合度达到80‑90％，可进行传代和冻存操作。 10 10 CN 114807031 A 说明书附图 1/3页 图1 图2 11 11 CN 114807031 A 说明书附图 2/3页 图3 图4 12 12 CN 114807031 A 说明书附图 3/3页 图5 13 13
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