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人脐带间充质细胞的获得方法
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本发明针对现有技术中获取人脐带间充质细胞数量不足的问题，提出了一种改进的方法。该方法通过对组织碎块反复转移和培养，显著提高了细胞收获量，在第3代培养时可获得4.04×10^10个细胞，第6代可达1.56×10^12个细胞，从而为临床治疗提供了充足资源。
间充质干细胞(MSC)是源自中胚层的一类干细胞，近些年研究发现MSC具有良好的可塑性和扩增能力，能为病损组织的修复再生提供祖细胞。Arnold1. caplan认为“利用培养法扩增的间充质干细胞对特定组织进行的大量重建或修复，已经远远超出了它们的正常利用和实用范围。”因此，不同组织来源的间充质干细胞成为各研究组的研究热点。脐带来源的MSC因来源充足且无创性，扩增技术成熟，成为许多研究小组设计大量扩增方案的聚焦点。C6cile DB研究组在培养第3代获得 7X IO9个细胞；Fong CY研究组的培养方案脐带MSC的生产效应是100%，获得的细胞数约为4 X IO6至5 X IO6个细胞/cm2脐带；有些研究技术使脐带的生产效应能达到100%但收获的细胞数却只够或不够一个病人的治疗剂量；有些研究技术脐带扩增到第3代的细胞数量是最多达7X109，这些扩增方案的细胞收获量均未突破IO9个细胞。
本发明提供了一种人脐带间充质细胞的获得方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决目前获取人脐带间充质细胞的方法收获人脐带间充质细胞的量过少而造成无法满足治疗剂量的问题。本发明的技术方案是 通过以下措施来实现的一种人脐带间充质细胞的获得方法，按下述步骤进行第一步，在无菌条件下人脐带活组织，洗净，切碎成组织碎块；第二步，将组织碎块放入培养皿中 ，并向其中加入低糖混合培养液，然后将培养皿放入CO2培养箱中进行培养，每3天至4天培养皿换一次低糖混合培养液；第三步，待培养皿中的组织碎块周边有梭形细胞爬出时后，将组织碎块移入新的培养皿中内，并向新的培养皿中加入低糖混合培养液，放入CO2培养箱中继续进行培养；第四步，反复重复第三步，直至最后一次转移的培养皿中的组织碎块周边不再有梭形细胞长出。下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进
上述CO2培养箱的培养条件可为37°C、3. 6% CO2、饱和湿度。上述第一步中可将活组织洗净后切碎成2 mm3至3mm3的小块。上述在第四步之后，可将每次转移出组织碎块后的培养皿底粘附的梭形细胞用低糖混合培养液培养，当细胞生长汇合为80%至95%后用胰蛋白酶消化获得细胞，收集获得后的细胞，离心，弃上清液，计数细胞，调节细胞浓度按要求密度重新接种入新培养皿中并向其中加入低糖混合培养液，待新培养皿内的细胞生长汇合达80%至95%后继续按此步骤进行消化。上述胰蛋白酶的浓度可为O. 5g/L至2. 5g/L，其中还添加有O. 53mmol/L的EDTA-Na2O
上述离心条件为转速可为1000r/min至1500r/min、时间为5min至lOmin。上述进行重新接种时的要求密度可为5 X IO3个细胞/cm2培养皿底面积至10 X IO3个细胞/cm2培养皿底面积。上述低糖混合培养液可为向低糖DMEM培养液中分别加入胎牛血清、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、L- α -磷酸抗坏血酸和青-链霉素溶液形成混合培养液，混合培养液中胎牛血清的体积浓度为15%、L-谷氨酰胺的浓度为2mM、碳酸氢钠的浓度为10. 2mM、L-α -磷酸抗坏血酸的浓度为50 μ g/mL、青霉素的浓度为100u/ml、链霉素的浓度为100ug/ml。本发明利用反复转移使脐带组织中的细胞反复移出，再将此细胞反复进行培养，从而达到大量获得细胞的目的，生产效应在100%的基础上，提高细胞的收获量，培养第3代获得4. 04 X 101°个细胞，培养第6代获得1. 56 X IO12个细胞，为临床组织工程和基因治疗提供充足的细胞源。
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。下面结合实施例对本发明作进一步描述
实施例1，该人脐带间充质细胞的获得方法按下述步骤进行第一步，在无菌条件下人脐带活组织，洗净，切碎成组织碎块；第二步，将组织碎块放入培养皿中，并向其中加入低糖混合培养液，然后将培养皿放入CO2培养箱中进行培养，每3天至4天培养皿换一次低糖混合培养液；第三步，待培养皿中的组织碎块周边有梭形细胞爬出时后，将组织碎块移入新的培养皿中内，并向新的培养皿中加入低糖混合培养液，放入CO2培养箱中继续进行培养；第四步，反复重复第三步，直至最后一次转移的培养皿中的组织碎块周边不再有梭形细胞长出。可根据实际需要，对上述人脐带间充质细胞的获得方法作进一步优化或/和改进
实施例2，作为上述实施例的优选，CO2培养箱的培养条件为37°C、3. 6% CO2、饱和湿度。3. 6% CO2中的百分数为体积百分数。实施例3，作为上述实施例的优选，第一步中将活组织洗净后切碎成2 mm3至3mm3的小块。实施例4，与上述实施例的不同之处在于，在第四步之后，将每次转移出组织碎块后的培养皿底粘附的梭形细胞用低糖混合培养液培养，当细胞生长汇合为80%至95%后用胰蛋白酶消化获得细胞，收集获得后的细胞，离心，弃上清液，计数细胞，调节细胞浓度按要求密度重新接种入新培养皿中并向其中加入低糖混合培养液，待新培养皿内的细胞生长汇合达80%至95%后继续按此步骤进行消化。80%和95%分别为汇合生长后细胞总面积占培养皿底面积的百分数。实施例5，作为上述实施例的优选，胰蛋白酶的浓度为O. 5g/L至2. 5g/L，其中还添加有 O. 53mmol/L 的 EDTA-Na2。实施例6,作为上述实施例的 优选,离心条件为转速为1000r/min至1500r/min、时间为 5min 至 IOmin。
实施例7，作为上述实施例的优选，进行重新接种时的要求密度为5X103个细胞/cm2培养皿底面积至IOX IO3个细胞/cm2培养皿底面积。实施例8，作为上述实施例的优选，低糖混合培养液为向低糖DMEM培养液中分别加入胎牛血清、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、L- α -磷酸抗坏血酸和青-链霉素溶液形成混合培养液，混合培养液中胎牛血清的体积浓度为15%、L-谷氨酰胺的浓度为2mM、碳酸氢钠的浓度为10. 2mM、L-α -磷酸抗坏血酸的浓度为50 μ g/mL、青霉素的浓度为100u/ml、链霉素的浓度为100ug/ml。实施例9，一种人脐带间充质细胞的获得方法按下述步骤进行第一步，无菌条件下将人脐带活组织切碎成2 mm3至3mm3的组织碎块；第二步，将组织碎块加入低糖混合培养液中，置入37°C、3. 6%C02培养箱中培养，每3天至4天培养皿换一次低糖混合培养液；第三步，培养15天至20天后见组织碎块周边有细胞移出，并生长为梭形细胞时将组织碎块移入新培养皿中，新培养皿中加入半量新的低糖混合培养液对组织碎块继续培养，3天至5天后组织碎块周边又有移出细胞长成梭形；第四步，此时将组织碎块再次移入新的培养皿中，组织块反复转移至少可达20次以上，直至培养的组织块周边不再有梭形细胞长成；第五步，转移出组织碎块的培养皿加入半量新的低糖混合培养液对细胞继续培养，当细胞培养至80%至95%并成漩涡状时，用胰蛋白酶消化细胞，将收获细胞计数后按8X IO3/ cm2进行分皿接种，为培养的第一代细胞，按此进行反复消化、分皿接种和培养，每轮细胞培养至第3代至6代。3. 6% CO2中的百分数为体积百分数,80%和95%分别为汇合生长后细胞总面积占培养皿底面积的百 分数。
1.一种人脐带间充质细胞的获得方法，其特征在于按下述步骤进行第一歩，在无菌条件下人脐带活组织，洗浄，切碎成组织碎块；第二步，将组织碎块放入培养皿中，并向其中加入低糖混合培养液，然后将培养皿放入CO2培养箱中进行培养，每3天至4天培养皿换一次低糖混合培养液；第三步，待培养皿中的组织碎块周边有梭形细胞爬出时后，将组织碎块移入新的培养皿中内，并向新的培养皿中加入低糖混合培养液，放入CO2培养箱中继续进行培养；第四步，反复重复第三步，直至最后一次转移的培养皿中的组织碎块周边不再有梭形细胞长出。
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质细胞的获得方法，其特征在于CO2培养箱的培养条件为37°C、3. 6% CO2、饱和湿度。
3.根据权利要求1或2所述的人脐带间充质细胞的获得方法，其特征在于第一歩中将活组织洗浄后切碎成2 mm3至3mm3的小块。
4.根据权利要求1或2或3所述的人脐带间充质细胞的获得方法，其特征在于在第四步之后，将每次转移出组织碎块后的培养皿底粘附的梭形细胞用低糖混合培养液培养，当细胞生长汇合为80%至95%后用胰蛋白酶消化获得细胞，收集获得后的细胞，离心，弃上清液，计数细胞，调节细胞浓度按要求密度重新接种入新培养皿中井向其中加入低糖混合培养液，待新培养皿内的细胞生长汇合达80%至95%后继续按此步骤进行消化。
5.根据权利要求4所述的人脐带间充质细胞的获得方法，其特征在于胰蛋白酶的浓度为 0. 5g/L 至 2. 5g/L，其中还添加有 0. 53mmol/L 的 EDTA-Na^
6.根据权利要求4或5所述的人脐带间充质细胞的获得方法，其特征在于离心条件为转速为 1000r/min 至 1500r/min、时间为 5min 至 lOmin。
7.根据权利要求4或5或6所述的人脐带间充质细胞的获得方法，其特征在于进行重新接种时的要求密度为5 X IO3个细胞/cm2培养皿底面积至IOX IO3个细胞/cm2培养皿底面积。
8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的人脐带间充质细胞的获得方法，其特征在于低糖混合培养液为向低糖DMEM培养液中分别加入胎牛血清、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、L- a -磷酸抗坏血酸和青-链霉素溶液形成混合培养液，混合培养液中胎牛血清的体积浓度为15%、L-谷氨酰胺的浓度为2mM、碳酸氢钠的浓度为10. 2mM、L-a -磷酸抗坏血酸的浓度为50 ii g/mL、青霉素的浓度为100u/ml、链霉素的浓度为100ug/ml。
本发明涉及生物医药技术领域，是一种人脐带间充质细胞的获得方法，一种人脐带间充质细胞的获得方法，按下述步骤进行第一步，在无菌条件下人脐带活组织，洗净，切碎成组织碎块；第二步，将组织碎块放入培养皿中，并向其中加入低糖混合培养液，然后将培养皿放入CO2培养箱中进行培养，每3天至4天培养皿换一次低糖混合培养液。本发明利用反复转移使脐带组织中的细胞反复移出，再将此细胞反复进行培养，从而达到大量获得细胞的目的，生产效应在100%的基础上，提高细胞的收获量，培养第3代获得4.04×1010个细胞，培养第6代获得1.56×1012个细胞，为临床组织工程和基因治疗提供充足的细胞源。
发明者温浩, 江明, 马艳, 卢晓梅, 朱启英, 毕晓娟, 段显琳 申请人:新疆医科大学第一附属医院
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