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二倍体细胞库建立标准操作SOPdoc
资料整理 资料整理 二倍体细胞库建立标准操作SOP 编号： SOP-ZL055-00 页 码： 1\4 版本号：01 修订号：00 机密等级： 秘密 起草人 起草日期 颁发部门 质量管理部 审核人 审核日期 批准人 批准日期 生效日期 分发清单 研发部[ ]质量管理部[ ] 综合管理部[ ]生产管理部[ ] 市场销售部[ ]财务部[ ] 目的 为了规范细胞库管理人员在主细胞库、工作细胞库建立过程中复苏、传 代、冻存的标准操作。 适用范围 本规程适用于人胚肺二倍体细胞（2BS株）主细胞库、工作细胞库的建立。 职责 3.1． 细胞培养岗位人员：负责严格按照本标准操作规程进行操作。 3.2． 细胞组长：检查细胞组人员的生产操作情况，确保操作的正确性。 3.3． 质量管理员：监督、检查本文件的执行情况。 术语 4.1 主细胞库(Master Cell Bank，MCB)：由原始细胞库（Primary Cell Bank）的细胞制备而成，分装于容器内，组成应均一，保存于-130℃ 或以下，用于制备工作细胞库（Working Cell Bank，WCB）。本细胞库的 细胞无论开瓶与否，均不得再返回贮存。 4.2 工作细胞库（Working Cell Bank，WCB）：由有限传代水平的主细胞库制 备而来的均一性细胞悬液，分装适宜体积于多个容器中，冻存于-130℃或 以下用于生产。本细胞库的细胞无论开瓶与否，均不得再返回贮存。 材料及设备 5.1 高压蒸汽灭菌类：橡胶塞、吸管（1ml、2ml、10ml）、毛吸管、100ml方 瓶、250m瓶、100ml离心瓶、2ml冻存管、不锈钢盆、不锈钢桶、无毛抹 布、吸球、C级区洁净服及口罩。 5.2 消毒剂：1﹪（ml/ml）来苏儿、5﹪（ml/ml）来苏儿、1‰（ml/ml）新洁 尔灭、5‰（ml/ml）新洁尔灭。 5.3 无菌液体：0.25%胰蛋白酶、8.0%（g/ml）碳酸氢钠、对照新生牛血清、新 生牛血清、E-MEM培养基、3.0%谷氨酰胺、二甲基亚砜、0.4%台盼兰。 5.4 设备： 倒置显微镜、离心机、低温冰箱、电热恒温水浴箱、层流罩、液氮 罐处于完好清洁状态。 5.5 其他物品：止血钳、冻存盒、医用手套、斜面架 6 流程图 见附件1《人胚肺二倍体细胞（2BS株）细胞库建立工作流程图》 7 内容 7.1 工作代细胞库建立 7.1.1 复苏（18→19代） 7.1.1.1 生产前检查 （1） 工作环境确认：细胞制备间（一）（29—WXBZBJY—C/A—08）在 C级局部A级洁净区内进行，温度控制在15～26℃,相对湿度控制在30～ 70%，相对压差≥5Pa。确认场地清场合格，无上批次生产遗留物，将清场 合格证贴在本批次对应的记录内。 （2） 设备、设施确认： a. 按照《层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认层流罩处 于完好状态。 b. 按照《倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认倒置 显微镜处于完好状态。 c. 按照《恒温室管理标准操作规程（使用、清洁、维护、保养）》确 认恒温室运行状态良好。 d. 按照《电热恒温水浴箱使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认 电热恒温水浴箱处于完好状态。 确认上述设备、设施完好且均在清洁、消毒有效期内。 （3） 文件记录检查 确认本工序标准操作规程、空白批生产记录和所用的标签、状态卡已 经到位。 （4）消毒剂确认 确认1‰新洁尔灭、5‰新洁尔灭、1﹪和5﹪来苏儿的批号和有效期。 7.1.1.2 操作前准备： （1） 按照工艺规程要求进行相应物品的准备工作。 （2）无菌液体确认：从低温冰库中取出0.25%胰蛋白酶、3.0%谷氨酰 胺、新生牛血清，核对批号、有效期，融化后待用；核对8.0%（g/ml） 碳酸氢钠、E-MEM培养基的批号和有效期，用1‰（ml/ml）新洁尔灭或 1﹪（ml/ml）来苏擦拭所有无菌液体瓶的外表面，经缓冲间进入C级区。 （3） 细胞种子确认：确认细胞名称、代次、批号及复苏支数。 7.1.1.3 生产操作 (1) 液体配制 操作前30分钟打开层流罩，日光灯。 a. 复苏液 81.2﹪（ml/ml）E-MEM+16.2﹪（ml/ml）新生牛血清+0.9﹪ （ml/ml）（3.0%谷氨酰胺）+1.6﹪（ml/ml）（8.0%碳酸氢钠）。按配方 计算出配制一定体积的复苏液所需E-MEM、新生牛血清、3.0%谷氨酰胺、 8.0%碳酸氢钠的体积；用10ml吸管抽取对应体积的各种液体加入MEN培养 基中，盖橡胶塞摇匀待用。 b. 生长液： 87.4﹪E-MEM+10﹪（ml/ml）新生牛血清+0.9﹪（ml/ml） （3.0%谷氨酰胺）+1.7﹪（ml/ml）（8.0%碳酸氢钠）。按配方计算出配制 一定体积的生长液所需E-MEM、新生牛血清、3.0%谷氨酰胺、8.0%碳酸氢钠 的体积；用10ml吸管抽取对应体积的各种液体加入MEN培养基中，盖橡 胶塞摇匀待用。 (2) 速融 电热恒温水浴箱设置温度为37℃；当水温达到37℃时，带上手套，按标签 所示取出装有人胚肺二倍体细胞的冻存管，检查外观无破损；核对批号、 代次无误后立即放入电热恒温水浴箱内，速融在1分钟完成。 (3) 分种 细胞速融后，立即送入细胞制备间，在A级工作台下用1‰新洁尔灭或1﹪ 来苏儿将冻存管表面彻底消毒。打开冻存管，用1ml吸管吸取0.5ml复苏 液加入冻存管中；用毛细管将冻存管中液体吸出，加入到一个100 ml方瓶 中（已预先加入适量复苏液），按此法，将全部细胞种子加入100ml方瓶 中；用毛细管充分吹打混匀，用10ml吸管按1:2分种率分种于100ml方瓶 中，每100ml方瓶补加复苏液至13～16ml，盖橡胶塞，细胞面朝下放置。 (4) 培养 在方瓶瓶壁上标记批号、代次、复苏日期，放入37℃±0.5℃恒温室中静止 培养6～10小时后换液。 (5) 换液 a. 细胞观察 待细胞已均匀贴壁即可准备换液。 b. 换液 在操作间A级工作台，倒弃旧液，分别加入15ml生长液。 (6) 培养 方瓶放入37±0.5℃恒温室中静止培养。 (7) 操作过程中出现偏差的情况按照《偏差管理标准操作规程》进行处理。 7.1.1.4 清场 (1) 在生产完成后清场操作前需在房间门上悬挂“待处理”标志牌， 关闭层流罩，日光灯。 (2) 按《生产区清场、清洁、消毒管理标准操作规程》对操作区域进行清 洁、消毒。 (3) 集液槽用5‰（ml/ml）新洁尔灭或5﹪（ml/ml）来苏儿溶液清洗 消毒及液封。 (4) 按要求正确悬挂状态标识。 (5) 废弃物装袋放固定位置送出。 7.1.1.5 细胞观察 观察细胞形态是否为典型成纤维状细胞、细胞是否贴壁、伸展、有无污染 以及是否光亮透明。于传代后第一天、第二天、第三天各观察一次，并做 记载。 7.1.1.6 及时填写《人胚肺二倍体细胞（2BS株）工作代细胞库建立记录》。 7.1.2 100ml方瓶细胞传代（19→21代） 7.1.2.1 生产前检查 （1） 工作环境确认：细胞制备间：在C级局部A级洁净区内进行，温度 控制在15～26℃,相对湿度控制在30～70%，确认场地清场合格，无上 批次生产遗留物，将清场合格证贴在本批次对应的记录内。 （2） 设备、设施确认： a. 按照《层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认层流罩处 于完好状态。 b. 按照《倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认倒置 显微镜处于完好状态。 c. 按照《恒温室管理标准操作规程（使用、清洁、维护、保养）》确认恒 温室运行状态良好。 d. 确认上述设备、设施完好且均在清洁、消毒有效期内。 (3) 文件记录检查 确认本工序标准操作规程、空白批生产记录和所用的标签、状态卡已经到位。 4） 1‰新洁尔灭、5‰新洁尔灭、1﹪来苏儿、5﹪来苏儿的批号和有效期 7.1.2.2 操作前准备 （1） 按照工艺规程要求进行相应物品的准备工作，并确认其在灭菌有 效期内。 （2） 无菌液体确认：从低温冰库中取出0.25%胰蛋白酶、3.0%谷氨酰 胺、新生牛血清，核对批号、有效期，融化后待用；核对8.0%（g/ml）碳 酸氢钠、E-MEM培养基的批号和有效期，用1‰（ml/ml）新洁尔灭或1﹪ （ml/ml）来苏儿擦拭所有无菌液体瓶的外表面，经缓冲间进入C级区。 （3） 细胞确认：确认细胞代次、数量、瓶型、日龄及细胞生长情况。 7.1.2.3 操作过程 （1） 液体配制：操作前30分钟打开层流罩，日光灯。 a. 消化液：以400ml体积装量的浓度为0.25﹪胰蛋白酶为基质液，加入 2.0﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠），盖橡胶塞摇匀待用。 b. 生长液： 87.4﹪E-MEM+10﹪（ml/ml）新生牛血清+0.9﹪ （ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+1.7﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氢钠）。 按配方计算出配置一定体积的生长液所需E-MEM、新生牛血清、L- 谷氨酰胺、碳酸氢钠的体积；用10ml吸管抽取对应体积的各种液体 加入E-MEN培养基中，盖橡胶塞摇匀待用。 (2) 消化：弃方瓶内生长液，加4～6ml消化液，待细胞表面呈松散状时弃 消化液。 (3) 传代：每个100ml方瓶内加8ml生长液，用10ml吸管反复吹打 细胞面，使所有细胞从瓶壁上脱下悬入生长液中，再吹打细胞使之分 散成单个状态；以1:4分种率分种方瓶内，每个100ml方瓶补加生长 液至13～16ml，轻轻摇匀后盖橡胶塞。 (4) 培养：在方瓶瓶壁上标记批号、代次、传代日期，放入37℃±0.5℃ 恒温室中静止培养。 (5) 操作过程中出现偏差的情况按照《偏差管理标准操作规程》进行处理。 7.1.2.4 清场： （1） 在生产完成后清场操作前需在房间门上悬挂“待处理”标志牌， 关闭层流罩，日光灯。 （2） 按《生产区清场、清洁、消毒管理标准操作规程》对操作区域进 行清洁、消毒。 （3） 集液槽用5‰（ml/ml）新洁尔灭或5﹪（ml/ml）来苏儿溶液清 洗消毒及液封。 （4） 按要求正确悬挂状态标识。 （5） 废弃物装袋放固定位置送出。 7.1.2.5 细胞观察 观察细胞形态是否为典型成纤维状细胞、细胞是否贴壁、伸展、有无污染 以及是否光亮透明、致密单层。于传代后第一天、第二天及第三天各观察 一次，并做记载。 7.1.2.6 及时填写《人胚肺二倍体细胞（2BS株）工作代细胞库建立记录》。 7.1.3 细胞传代（21→23） 此项传代程序同7.1.2项。 7.1.4 细胞传代（23→24） 细胞传代时分种率为1:2，其他程序同7.1.2项。 7.1.5 换液 7.1.5.1 生产前检查 (1) 工作环境确认：细胞制备间（一）在C级局部A级洁净区内进行，温 度控制在15～26℃,相对湿度控制在30～70%，确认场地清场合格，无上 批次生产遗留物，将清场合格证贴在本批次对应的记录内。 (2) 设备、设施确认： a. 按照《层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认层流罩处 于完好状态。 b. 按照《倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认倒置显微 镜处于完好状态。 c. 按照《恒温室管理标准操作规程（使用、清洁、维护、保养）》确 认恒温室运行状态良好。 d. 确认上述设备、设施均在清洁、消毒有效期内。 (3) 文件记录检查 确认本工序标准操作规程、空白批生产记录和所用的标签、状态卡已 经到位。 (4) 消毒剂确认 确认1‰新洁尔灭、5‰新洁尔灭、1﹪来苏儿、5﹪来苏儿的批号和有 效期。 7.1.5.2 操作前准备： (1) 按照工艺规程要求进行相应物品准备工作，并确认其在灭菌有效 期内。 （2）无菌液体确认：从低温冰库中取出0.25%胰蛋白酶、3.0%谷氨酰 胺、新生牛血清，核对批号、有效期，融化后待用；核对8.0%（g/ml）碳 酸氢钠、E-MEM培养基的批号和有效期，用1‰（ml/ml）新洁尔灭或1﹪ （ml/ml）来苏儿擦拭所有无菌液体瓶的外表面，经缓冲间进入C级区。 (3) 细胞确认：确认细胞代次、数量、瓶型、日龄及细胞生长情况。 7.1.5.3 操作过程 (1) 液体配制：操作前30分钟打开层流罩。 生长液（换液用）:80.9﹪E-MEM+16.2﹪（ml/ml）新生牛血清+0.9﹪ （ml/ml）（3.0%谷氨酰胺）+2.0﹪（ml/ml）（8.0%碳酸氢钠）。按配方 计算出配置一定体积的生长液液所需8.0%碳酸氢钠、新生牛血清、3.0%谷 氨酰胺的体积；用10ml吸管抽取对应体积的各种液体加入E- MEM中，盖 橡胶塞摇匀待用。 (2) 换加生长液：冻存前24小时，细胞换一次生长液。即弃掉旧液， 每瓶再加入13～16ml生长液。 (3) 培养：在方瓶瓶壁上标记批号、代次、传代日期，放入37℃±0.5℃恒 温室中培养。 (4) 操作过程中出现偏差的情况按照《偏差管理标准操作规程》进行处 理。 7.1.5.4 清场： (1) 在生产完成后清场操作前需在房间门上悬挂“待处理”标志牌关闭 层，流罩，日光灯。 (2) 按《生产区清场、清洁、消毒管理标准操作规程》对操作区域进行清 洁、消毒。 (3) 集液槽用5‰（ml/ml）新洁尔灭或5﹪（ml/ml）来苏儿溶液清洗 消毒及液封。 (4) 按要求正确悬挂状态标识。 (5) 废弃物装袋放固定位置送出。 7.1.5.5 及时填写《人胚肺二倍体细胞（2BS株）工作代细胞库建立记录》。 7.1.6 细胞冻存 7.1.6.1 生产前检查 (1) 工作环境确认：细胞制备间在C级局部A级洁净区内进行，温度控制 在15～26℃,相对湿度控制在30～70%，确认场地清场合格，无上批次生产 遗留物，将清场合格证贴在本批次对应的记录内。 (2) 设备、设施确认： a.按照《层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认层流罩处于完 好状态。 b.按照《倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认倒置 显微镜处于完好状态。 c.按照《离心机使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认离心机处于完 好状态。 d.按照《低温冰箱使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认普通冰 箱处于完好状态。 e.按照《液氮罐使用、清洁、维护保养标准操作规程》确认液氮罐处 于完好状态。 f.确认上述设备、设施完好，并在清洁、消毒有效期内。 (3) 文件记录检查 确认本工序标准操作规程、空白批生产记录和所用的标签、状态卡已 经到位。 (4) 消毒剂确认 确认1‰新洁尔灭、5‰新洁尔灭、1﹪来苏儿、5﹪来苏儿的批号和有 效期。 7.1.6.2 操作前准备： (1) 按照工艺规程要求进行相应物品准备工作，并确认其在灭菌有效 期内。 (2) 无菌液体确认：从低温冰库中取出0.25%胰蛋白酶、3.0%谷氨酰 胺、新生牛血清，核对批号、有效期，融化后待用；核对8.0%（g/ml）碳 酸氢钠、E-MEM培养基的批号和有效期，用1‰（ml/ml）新洁尔灭或1﹪ （ml/ml）来苏儿擦拭所有无菌液体瓶的外表面，经缓冲间进入C级区。 (3) 细胞确认：确认细胞代次、批号、数量、日龄及细胞生长情况。 7.1.6.3 操作过程 (1) 液体配制：操作前30分钟打开层流罩，日光灯。 a. 消化液：以400ml体积装量的浓度为0.25﹪胰蛋白酶为基质液，加 入2.0﹪（ml/ml）（8.0%碳酸氢钠），盖橡胶塞摇匀待用。 b. 冻存液:80.9﹪E-MEM+16.2﹪（ml/ml）新生牛血清+0.9﹪（ml/ml） （3.0﹪谷氨酰胺）+2.0﹪（ml/ml）（8.0%碳酸氢钠）；按配方计算出配 置一定体积的冻存液所需E-MEM、新生牛血清、3.0﹪谷氨酰胺、8.0﹪碳酸 氢钠的体积；用10ml吸管抽取对应体积的各种液体加入MEN培养基中，盖 橡胶塞摇匀待用。 c. 生长液（离心用）： 87.4﹪（ml/ml）E-MEM +10﹪（ml/ml）新生牛血 清+0.9﹪（ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+1.7﹪（ml/ml）（8.0%碳酸氢钠） ；按配方计算出配置一定体积的生长液所需E-MEM、新生牛血清、3.0﹪谷 氨酰胺、8.0﹪碳酸氢钠的体积；用10ml吸管抽取对应体积的各种液体加 入MEN培养基中，盖橡胶塞摇匀待用。 (2) 消化：弃方瓶内生长液，加4～6ml消化液，于操作台静置，待细胞表 面呈松散状时弃消化液，。 (3) 吹打、分散细胞 在每瓶中分别加入8ml生长液，用10ml 吸管轻轻吹打细胞面，使所有瓶壁 上的细胞脱落悬入分散液中，再吹打几下，使细胞分散成单个状态。 （4） 收集细胞 将所有细胞瓶中的细胞平均收集到100mL离心瓶中，在每个细胞瓶中加入 4～10ml生长液进行冲洗，吸出加入离心瓶中，盖橡胶塞、编号。 （5） 离心细胞 每分钟1000转离心10分钟。 （6） 分散细胞 冻存液作为吹打液,用10ml吸管进行分散，之后将细胞悬液收集在250ml 瓶中，然后再往每个离心瓶中加入2ml冻存液冲洗，吸出冻存液加入到 250mL的瓶中。 （7） 滴加二甲基亚砜 用10ml吸管抽取二甲基亚砜缓慢滴入收集有细胞悬液的250ml瓶中，并充 分混匀。 （8） 活细胞计数：取样检测细胞成活率≥90%。 （9）稀释细胞悬液：冻存细胞以5×106～7/ml为适宜浓度，用冻存液将细 胞悬液稀释至此终浓度。 （10） 分装 用2mL吸管抽取1.2ml细胞悬液，分装在冻存管中，直至细胞悬液分完。 （11） 冻存 将冻存管装入冻存盒，放入一个标签，注明细胞的批号、世代、支数、流 水号、冻存时间、操作者，完成后移入4℃2小时，-20℃2小时，-60℃2 小时，在液氮罐中悬冻过夜，次日浸入液氮中。 (12) 已冻存的细胞抽取样品做细胞检定。 (13) 操作过程中出现偏差的情况按照《偏差管理标准操作规程》进 行处理。 7.1.6.4 清场 （1） 在生产完成后清场操作前需在房间门上悬挂“待处理”标志 牌，关闭层流罩，日光灯。 （2） 按《生产区清场、清洁、消毒管理标准操作规程》对操作区域 进行清洁、消毒。 （3） 集液槽用5‰（ml/ml）新洁尔灭或5﹪（ml/ml）来苏儿溶液清 洗消毒及液封。 (4) 按要求正确悬挂状态标识。 (5) 废弃物装袋放固定位置送出。 7.1.6.5 及时填写完成《人胚肺二倍体细胞（2BS株）工作代细胞库建立记录》。 7.2 主代细胞
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