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　　细胞培养标准操作程序 （SOP） 1．目的 ： 为了保证培养细胞的正常生长， 实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤， 特制订 实验室细胞培养操作流程。 2．适用范围： 适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。 3．操作规程： 培养液、 PBS、胰蛋白酶的配制 1000ml 培养液的配制 1、准备用品：培养粉、 1000ml 烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、 PH仪、 2 ～3 天内的新鲜三蒸水 （或新鲜反渗水）、 NaHCO3粉、 1000ml 无菌玻璃瓶（ 100ml×10 个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、 2 ～ 3 个过 滤器、注射器。紫外线ml 新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。 3、充分搅拌，按说明添加成分（如 Invitrogen 公司的 RPMI-1640 配制 1000ml 需加 NaHCO3粉， Invitrogen 公司的 DMEM需加 NaHCO3粉等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。 4、用 1M （1mol/L ）HCl 调 PH至左右（细胞适宜在～生长，配制好后 PH值会升高～，故配时调 PH 至左右）。 5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到 1000ml。 6、配青霉素 80 万/ 瓶 + 4ml 蒸馏水 溶解 配链霉素 100 万/ 瓶 + 4ml 蒸馏水 溶解 取青霉素和链霉素加入到 1000ml 培养液中，使其终浓度均为 100U/ml ，充分搅拌混匀。 7、在无菌操作台里用的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到 100ml 玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄 膜封口，盖上橡皮塞，放 -20 ℃保存备用。 注意： （1）配制培养液及调节培养液 PH值所使用的 HCl 和（或） NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。 一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。 （2 ）准备的 100ml×10 个玻璃瓶必须事先高压灭菌 ！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗 水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。 PBS （平衡盐溶液）的配制 NaCl 8g KCl ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至 1000ml 2 Na2HPO4*HO KH2PO4 （1） 无需调 PH值，其成分溶解后 PH为，不需除菌滤膜过滤除菌，放于 4℃保存，用前直接高压灭菌 （高压时，装 PBS的瓶子的瓶盖要插针头 ! ） （2 ） Na2HPO4*H2O 则 Na2HPO4*12 H2O需 （3） 如欲配制 500ml ，以上成分减半即可 %胰蛋白酶的配制 胰蛋白酶粉 EDTA （乙二胺四乙酸二钠） NaCl KCl ` + 新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至 1000ML NaHCO3 Glucose( 葡萄糖 ) 酚红 （1）配出来的 PH值为，在 PH值～范围内，故不需调 PH值。 （2 ）用的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放 -20 ℃保存备用。 4℃可连续使用 1 月左右。 （3 ）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器 均不需高压灭菌，干净即可。 （4 ）如欲配制 500ml，以上成分减半即可 细胞复苏 1、准备：紫外线min ，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前 放水浴箱里温育 20 分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右 边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。 2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基 5ml 加入试管中（一滴约为 50ul ）。 3、戴手套，从 -196 ℃液氮罐中取出冻存管，立即放入 37 ℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻 存管，保证冻存管内细胞 1min 内融化。以 70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 （慢冻快融 ） 4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管， 800rpm 离心 2min （用培养基且离心的目的 : 去除细胞冷冻保护剂 DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上 清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、 FBS （胎牛血清）各 80 滴和 20 滴（使 FBS浓度为 20 ％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。 5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培 养瓶放入 CO2培养箱。（ 注意 ：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇 晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。） 6、收拾所用物品、用 75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。 注意： （1）入细胞室前观察 CO2%压力，左右，减压器表压力不低于！ （2 ）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让 FBS浓度达到 20％。 （3）离心时间为 1～2min ，速度为 800 转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。 （4 ）滴管使用注意事项： a. 吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。 b. 培养基和 FBS （胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！ c. FBS （胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管 , 因为血清对胰酶活性有抑制作用。 d．胰酶和 PBS （平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开 （5）不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长（如 2 年以上），技术不过关（如吹 打太激烈）、细胞传代数太多等。 （6）关于 PBS （平衡盐溶液） : a. PBS 溶液配好后要高压灭菌后才能用； PBS高压时其瓶塞一定要插针头。 b. PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质， 但需用温过的 PBS冲洗细胞中的杂质。 PBS 虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。 c ．不温的 PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。 d．消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入 2 ～ 3ml PBS （防止培养瓶干燥），培养瓶 放 CO2培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把 PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即 可再用。 （7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大， 而在 4 ℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞 复苏后应及时洗涤冷冻保护剂 DMSO（离心后弃去上清），防止 DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！ 细胞换液 1、倒置显微镜下观察细胞生长状态： a. 移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞； b. 生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生 长期时可以见到很多分裂期细胞。 c. 生长状态不良的细胞 : 细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞 间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点。 d. 只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。 2、紫外线min ，准备好吸管、试管饭盒，温育培养基， FBS （胎牛血清）可不温。实验开始时 打开照明灯和抽风机，用 75%酒精喷双手。酒精灯点燃放中间。滴管放滴管架上，从左到右顺序为：吸细 胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸 FBS （胎牛血清）的滴管。从水浴箱中取出培养基，擦干水放入操作台 的左边。 3、从 CO2培养箱中取出细胞培养瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处（注意不要把胶盖烧 焦），滴管（前端 90%部位）灼烧。细胞培养瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸 干净。注意：滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内，避免产生气泡，且不要伸入瓶内太多，防止造成 污染；滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗（要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗）！ 4、用吸培养基的滴管吸取培养基 90 滴加入到培养瓶（ 25c ㎡）中，再用吸 FBS （胎牛血清） 的滴管吸取 FBS 10 滴加入到培养瓶中。（使 FBS浓度为 10％） 5、旋紧细胞培养瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通。平放回 CO2培养箱中。 6、收拾所用物品、用 75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。 注意 : （1）在打开培养基、 FBS （胎牛血清）、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格注意无菌操 作。灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。 （2 ）镊子每次使用前均需灼烧。装 FBS 的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖 上；取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。 （3）滴管在第一次使用前也需灼烧。注意：除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空 滴加。 已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！ （4 ）培养瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。 （5）培养液以没过细胞为宜。 （6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液。不要求每天换液，容易增加污染机会。 细胞计数 1、原理： （1）计算细胞数目用血球计数盘计数。 （2 ）血球计数盘一般有二个 chambers ，每个 chamber 中细刻 9 个 1mm2大正方形，其中 4 个角落之 正方形再细刻 16 个小格，深度均为。当 chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为 1mm2×=。使 4 用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以 10 ，即为每 ml 中之细胞数目。 细胞数 /ml ＝4 大格细胞总数 / 4 ×10 4 注意： 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10%以上，说明分散 不好，需重新制备细胞悬液。 2、计数方法： (1) 75% 酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片。 (2) 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边，再用加样枪吹打混匀该滴液体， 从中吸取 13ul 至盖玻片边缘（注意不要溢出，不要有气泡）。 (3) 观察计数： 压线的记左不记右， 记上不记下； 成团的细胞只记为 1 个；先用低倍镜 （红色，4×） 找出大位置，再用中倍镜（黄色， 10×）进行计数。 细胞数 /ml ＝4 大格细胞总数 / 4 ×10 4 (4) 计数完毕用 75%酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干纱布（或干棉签）擦一遍。 细胞传代 1、紫外线min，准备好细胞培养所需物品。 2、取灭菌试管 1 支，配完全培养基（含 10%FBS）3ml （培养基 :FBS=54 滴： 6 滴 ）。 3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。 4、胰酶消化 ：加入约 1ml （20 滴）胰酶到培养瓶里消化。胰酶铺平培养瓶底为佳。倒置显微镜下观 察培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴 管吸出胰酶弃去， 把细胞培养瓶放入 CO2培养箱让残存的胰酶继续消化， （在37℃胰酶消化效果最佳） 。 5 、每 1min 把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆，透亮，细胞间隙明显增大时 , 用吸细胞液 的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基 3ml 加入到培养瓶中终止消化。 6 、用吸细胞液的滴管 轻柔吹打 ，保证培养瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽略（可以把滴管卡在瓶 口处吹打斜坡处。吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害；需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害。 新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打 5 次，靠近瓶口端处的角落也要吹到），把培养瓶中所有细胞悬液 用吸细胞液的滴管移入试管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液。 7、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验，

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