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一种CIK细胞库的构建方法pdf
本发明公开了CIK细胞库的构建方法，步骤依次包括：采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞，扩增培养CIK细胞，CIK细胞检测，CIK细胞冻存，编码入库并上传细胞信息档案。本发明属于细胞库构建技术领域，具体是指一种基于CIK细胞库的构建方法。
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 113445132 A (43)申请公布日 2021.09.28 (21)申请号 0.8 (22)申请日 2021.04.06 (71)申请人 海南优尼科尔生物科技有限公司 地址 570311 海南省海口市秀英区南海大 道192号 (72)发明人 王晓宇李崴郭康合林冠妃 李秋宛 (74)专利代理机构 北京盛凡智荣知识产权代理 有限公司 11616 代理人 叶似锦 (51)Int.Cl. C40B 50/06 (2006.01) C12N 5/0783 (2010.01) A01N 1/02 (2006.01) 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 (54)发明名称 一种CIK细胞库的构建方法 (57)摘要 本发明公开了CIK细胞库的构建方法，步骤 依次包括：采集人外周血，分离自体血浆，分离外 周血单个核细胞，扩增培养CIK细胞，CIK细胞检 测，CIK细胞冻存，编码入库并上传细胞信息档 案。本发明属于细胞库构建技术领域，具体是指 一种基于CIK细胞库的构建方法。 A 2 3 1 5 4 4 3 1 1 N C CN 113445132 A 权利要求书 1/2页 1.一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤： 1)采集人外周血； 2)分离自体血浆； 3)分离外周血单个核细胞； 4)扩增培养CIK细胞； 5)CIK细胞检测； 6)CIK细胞冻存； 7)编码入库并上传细胞信息档案。 2.根据权利要求1所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中的采 集人外周血是将人外周血采集至含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋中。 3.根据权利要求2所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中的分 离自体血浆的方法，包括如下步骤： 1)将采血袋中含枸橼酸钠抗凝剂的人外周血转移至50ml离心管，利用离心机进行离 心； 2)离心条件：4℃，1000‑2800rpm离心5‑20min，离心机调节升速1‑9，降速1‑9； 3)取上层淡黄色液体至新的50ml离心管，置于56℃水浴锅中灭活30min后，3000‑ 3500rpm离心3‑8min收集上清得到自体血浆，置于‑20℃冻存备用。 4.根据权利要求3所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中的分 离外周血单个核细胞的方法，包括如下步骤： 1)将去除自体血浆后的下层红色液体按照体积量计用生理盐水对倍稀释吹打混匀； 2)加入其0‑2倍体积的0wt％‑6wt％的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置0‑40min，缓慢地将 20‑25ml红色液体和/或上清液加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中，使其与淋巴细胞 分离液形成一个明显的分层； 3)利用离心机进行离心分离，离心条件：4℃，1800‑5000rpm离心10‑30min，离心机调节 升速1‑3，降速1‑3； 4)吸取底部红细胞的上层所有液体并转移至新的50ml离心管中； 5)利用离心机进行离心分离，离心条件：4℃，1500‑3000rpm离心3‑15min，离心机调节 升速6‑9，降速6‑9； 6)弃上清，用40ml生理盐水清洗细胞沉淀，取0.5ml细胞悬液用于细胞计数计算细胞回 收率； 7)剩余细胞悬液利用离心机离心洗涤，离心条件：4℃，1500‑3000rpm离心3‑15min，离 心机调节升速6‑9，降速6‑9，离心所得沉淀即为外周血单个核细胞。 5.根据权利要求4所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤4)的扩增 培养CIK细胞的方法，包括如下步骤： 1)将获得的外周血单个核细胞接种于T175培养瓶中，补加GT‑T551H3培养基，0‑20％的 自体血浆和终浓度为(500‑1500)U/ml的IL‑2、(100～1500)U/mL的IFN‑γ以及(10～100) 6 ng/mL抗CD3单克隆抗体使接种密度为1×10个/ml，置于培养条件为温度36.5～37.5℃、CO2 浓度4.5～5.5％、饱和湿度条件下培养，此天设为第0d； 2)CIK细胞培养第3d开始补加GT‑T551培养基、IL‑2及自体血浆，其中，IL‑2和自体血浆 2 2 CN 113445132 A 权利要求书 2/2页 的补加量按新补充培养体系的体积计算； 3)在培养第5、7、9、11d，充分吹打悬浮细胞，收集细胞计数，根据细胞数量再补充GT‑ T551培养基、IL‑2及自体血浆，IL‑2及自体血浆补加量按新补充的培养体系的体积计算， GT‑T551培养基的使用量为3L，自体血浆全部用于补液； 4)培养第14d或细胞生长至100亿后收集全部细胞并冻存。 6.根据权利要求5所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤5)中CIK细 胞检测为在培养第12d，对CIK细胞进行支原体、细菌、内毒素、表型、细胞杀伤能力、细胞活 性检测。 7.根据权利要求6所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤6)中CIK细 8 胞的冻存方法：将培养第14d得到的合格的CIK细胞以0.5‑10×10个/ml的密度进行分装冻 存，冻存液的配方为(0‑10)wt％DMSO+(0‑10)wt％右旋糖苷+(80‑90)wt％人血白蛋白。 8.根据权利要求7所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤7)中CIK细 胞的编码入库为按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编码、制备培养冻存记录和保 存位置信息纸质版归档并统一输入计算机记录。 3 3 CN 113445132 A 说明书 1/6页 一种CIK细胞库的构建方法 技术领域 [0001] 本发明属于细胞库构建技术领域，具体是指一种基于CIK细胞库的构建方法。 背景技术 [0002] 19世纪80年代兴起的细胞过继免疫治疗带给了肿瘤患者新的希望。细胞因子诱导 的杀伤细胞(cytokine‑induced killer,CIK)是一群由多种细胞因子(IFN‑γ、IL‑2、IL‑1 等)、抗CD3抗体联合诱导的以CD3+和CD56+T细胞为主的异质细胞，通过细胞毒T细胞 (cytotoxiclymphocyte，CTL)溶胞效应和细胞凋亡途径发挥抗肿瘤作用，并能消除术后微 小残留病灶，防止癌细胞扩散与肿瘤复发，是一种新型的过继免疫疗法中的主要功能细胞。 生理状态下，表达CD3+和CD56+T淋巴细胞在正常人体外周血中占(1‑5)％，远不能满足临床 治疗的需要。随着体外扩增技术的日趋完善，为临床提供足量的CD3+和CD56+效应T 细胞成 为现实。然而，随着年龄的增长人体内的CIK细胞活性会逐渐下降，待有需要时难以满足使 用需求，趁着年轻将细胞储存下来成为一种新的选择。为了便于人们有效储存和使用有效 的组织和细胞资源，目前在世界范围内已经有多种细胞库或者组织库建立，如脐血造血干 细胞库，间充质干细胞库等。所谓的细胞库是指大规模生产制备与长期在约为‑196℃液氮 中贮存可溯源的细胞及搜集相关资料的场所。 发明内容 [0003] 为了解决上述难题，本发明提供了一种基于CIK细胞库的构建方法。 [0004] 为了实现上述功能，本发明采取的技术方案如下：一种基于CIK细胞库的构建方 法，包括如下步骤： [0005] 1)采集人外周血； [0006] 2)分离自体血浆； [0007] 3)分离外周血单个核细胞； [0008] 4)扩增培养CIK细胞； [0009] 5)CIK细胞检测； [0010] 6)CIK细胞冻存； [0011] 7)编码入库并上传细胞信息档案。 [0012] 作为优选，用于提供所述人外周血的供者为在人外周血采集前符合献血标准的供 者。 [0013] 作为优选，所述步骤1)中的采集人外周血是将人外周血采集至含枸橼酸钠抗凝剂 的采血袋中。 [0014] 进一步地，所述步骤2)中的分离自体血浆的方法，包括如下步骤： [0015] 1)将采血袋中含枸橼酸钠抗凝剂的人外周血转移至50ml离心管，利用离心机进行 离心； [0016] 2)离心条件：4℃，1000‑2800rpm离心5‑20min，离心机调节升速1‑ 9，降速1‑9； 4 4 CN 113445132 A 说明书 2/6页 [0017] 3)取上层淡黄色液体至新的50ml离心管，置于56℃水浴锅中灭活30 min后，3000‑ 3500rpm离心3‑8min收集上清得到自体血浆，置于‑20℃冻存备用。 [0018] 进一步地，所述步骤3)中的分离外周血单个核细胞的方法，包括如下步骤： [0019] 1)将去除自体血浆后的下层红色液体按照体积量计用生理盐水对倍稀释吹打混 匀； [0020] 2)加入其0‑2倍体积的0wt％‑6wt％的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置0‑40min，缓慢 地将20‑25ml红色液体和/或上清液加入到含20ml 淋巴细胞分离液的离心管中，使其与淋 巴细胞分离液形成一个明显的分层； [0021] 3)利用离心机进行离心分离，离心条件：4℃，1800‑5000rpm离心10‑ 30min，离心 机调节升速1‑3，降速1‑3； [0022] 4)吸取底部红细胞的上层所有液体并转移至新的50ml离心管中； [0023] 5)利用离心机进行离心分离，离心条件：4℃，1500‑3000rpm离心3‑ 15min，离心机 调节升速6‑9，降速6‑9； [0024] 6)弃上清，用40ml生理盐水清洗细胞沉淀，取0.5ml细胞悬液用于细胞计数计算细 胞回收率； [0025] 7)剩余细胞悬液利用离心机离心洗涤，离心条件：4℃，1500‑3000rpm 离心3‑ 15min，离心机调节升速6‑9，降速6‑9，离心所得沉淀即为外周血单个核细胞。 [0026] 进一步地，所述步骤4)的扩增培养CIK细胞的方法，包括如下步骤： [0027] 1)将获得的外周血单个核细胞接种于T175培养瓶中，补加GT‑T551 H3培养基，0‑ 20％的自体血浆和终浓度为(500‑1500)U/ml的IL‑ 2、(100～1500)U/mL的IFN‑γ以及(10 6 ～100)ng/mL抗CD3 单克隆抗体使接种密度为1×10个/ml，置于培养条件为温度 36.5～ 37.5℃、CO浓度4.5～5.5％、饱和湿度条件下培养，此天设为第0d； 2 [0028] 2)CIK细胞培养第3d开始补加GT‑T551培养基、IL‑2及自体血浆，其中，IL‑2和自体 血浆的补加量按新补充培养体系的体积计算； [0029] 3)在培养第5、7、9、11d，充分吹打悬浮细胞，收集细胞计数，根据细胞数量再补充 GT‑T551培养基、IL‑2及自体血浆，IL‑2及自体血浆补加量按新补充的培养体系的体积计 算，GT‑T551培养基的使用量为3L，自体血浆用于补液至用完为止； [0030] 4)培养第14d或细胞生长至100亿后收集全部细胞并冻存。 [0031] 进一步地，所述步骤5)中CIK细胞检测为在培养第12d，对CIK细胞进行支原体、细 菌、内毒素、表型、细胞杀伤能力、细胞活性检测，用于判断 CIK细胞的扩增质量及扩增效 率。 [0032] 进一步地，所述步骤6)中CIK细胞的冻存方法：将培养第14d得到的合格的CIK细胞 8 以0.5‑10×10个/ml的密度进行分装冻存，冻存液的配方为(0‑ 10)wt％DMSO+(0‑10)wt％ 右旋糖苷+(80‑90)wt％人血白蛋白。 [0033] 进一步地，所述步骤7)中CIK细胞的编码入库为按照每人一组系统编号，并将个人 信息包括编码、制备培养冻存记录和保存位置信息纸质版归档并统一输入计算机记录，用 于管理和检索。 [0034] 本发明采取上述结构取得有益效果如下：本发明提供的CIK细胞库的构建方法，构 建人成体外周血CIK细胞库，将人健康的或者年轻的CIK细胞通过一定方法建库，是充分保 5 5 CN 113445132 A 说明书 3/6页 存和利用现有CIK细胞资源的有效方法，它为存储自体或者异体在需要采用免疫细胞治疗 技术时提供有力的支持，具有重要的意义。 附图说明 [0035] 图1为一种人外周血CIK细胞库的构建方法的流程图； 具体实施方式 [0036] 下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术 人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0037] 如图1所示，本发明一种CIK细胞库的构建方法，包括如下步骤： [0038] 1)采集人外周血； [0039] 2)分离自体血浆； [0040] 3)分离外周血单个核细胞； [0041] 4)扩增培养CIK细胞； [0042] 5)CIK细胞检测； [0043] 6)CIK细胞冻存； [0044] 7)编码入库并上传细胞信息档案。 [0045] 用于提供所述人外周血的供者为在人外周血采集前符合献血标准的供者。 [0046] 所述步骤1)中的采集人外周血是将人外周血采集至含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋 中。 [0047] 所述步骤2)中的分离自体血浆的方法，包括如下步骤： [0048] 1)将采血袋中含枸橼酸钠抗凝剂的人外周血转移至50ml离心管，利用离心机进行 离心； [0049] 2)离心条件：4℃，1000‑2800rpm离心5‑20min，离心机调节升速1‑ 9，降速1‑9； [0050] 3)取上层淡黄色液体至新的50ml离心管，置于56℃水浴锅中灭活30 min后，3000‑ 3500rpm离心3‑8min收集上清得到自体血浆，置于‑20℃冻存备用。 [0051] 所述步骤3)中的分离外周血单个核细胞的方法，包括如下步骤： [0052] 1)将去除自体血浆后的下层红色液体按照体积量计用生理盐水对倍稀释吹打混 匀； [0053] 2)加入其0‑2倍体积的0wt％‑6wt％的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置 0‑40min，缓 慢地将20‑25ml红色液体和/或上清液加入到含20ml 淋巴细胞分离液的离心管中，使其与 淋巴细胞分离液形成一个明显的分层； [0054] 3)利用离心机进行离心分离，离心条件：4℃，1800‑5000rpm离心10‑ 30min，离心 机调节升速1‑3，降速1‑3； [0055] 4)吸取底部红细胞的上层所有液体并转移至新的50ml离心管中； [0056] 5)利用离心机进行离心分离，离心条件：4℃，1500‑3000rpm离心3‑ 15min，离心机 调节升速6‑9，降速6‑9； [0057] 6)弃上清，用40ml生理盐水清洗细胞沉淀，取0.5ml细胞悬液用于细胞计数计算细 6 6 CN 113445132 A 说明书 4/6页 胞回收率； [0058] 7)剩余细胞悬液利用离心机离心洗涤，离心条件：4℃，1500‑3000rpm 离心3‑ 15min，离心机调节升速6‑9，降速6‑9，离心所得沉淀即为外周血单个核细胞。 [0059] 所述步骤4)的扩增培养CIK细胞的方法，包括如下步骤： [0060] 1)将获得的外周血单个核细胞接种于T175培养瓶中，补加GT‑T551 H3培养基，0‑ 20％的自体血浆和终浓度为(500‑1500)U/ml的IL‑ 2、(100～1500)U/mL的IFN‑γ以及(10 6 ～100)ng/mL抗CD3 单克隆抗体使接种密度为1×10个/ml，置于培养条件为温度 36.5～ 37.5℃、CO浓度4.5～5.5％、饱和湿度条件下培养，此天设为第0d； 2 [0061] 2)CIK细胞培养第3d开始补加GT‑T551培养基、IL‑2及自体血浆，其中，IL‑2和自体 血浆的补加量按新补充培养体系的体积计算； [0062] 3)在培养第5、7、9、11d，充分吹打悬浮细胞，收集细胞计数，根据细胞数量再补充 GT‑T551培养基、IL‑2及自体血浆，IL‑2及自体血浆补加量按新补充的培养体系的体积计 算，GT‑T551培养基的使用量为3L，自体血浆用于补液至用完为止； [0063] 4)培养第14d或细胞生长至100亿后收集全部细胞并冻存。 [0064] 所述步骤5)中CIK细胞检测为在培养第12d，对CIK细胞进行支原体、细菌、内毒素、 表型、细胞杀伤能力、细胞活性检测，用于判断CIK细胞的扩增质量及扩增效率。 [0065] 所述步骤6)中CIK细胞的冻存方法：将培养第14d得到的合格的CIK 细胞以0.5‑10 8 ×10 个/ml的密度进行分装冻存，冻存液的配方为10 wt％DMSO+(0‑10)wt％右旋糖苷+ (80‑90)wt％人血白蛋白。 [0066] 所述步骤7)中CIK细胞的编码入库为按照每人一组系统编号，并将个人信息包括 编码、制备培养冻存记录和保存位置信息纸质版归档并统一输入计算机记录，用于管理和 检索。 [0067] 实施例1 [0068] 一种人外周血CIK细胞库的构建方法，包括以下步骤： [0069] 1)采集健康供者外周血100ml至含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋中，无菌条件下转移 至50ml离心管中，利用离心机进行离心，离心条件：4℃，2500 rpm，10min，升8降8，取上层淡 黄色液体至新的50ml离心管中置于56℃水浴锅中灭活30min，利用离心机进行离心分离，离 心条件：4℃，3000 rpm，离心8min，升8降8，收集上清液，即为自体血浆，置于‑20℃冰箱备 用； [0070] 2)外周血单个核细胞的分离：将去除自体血浆后的下层红色液体按照体积量计用 生理盐水对倍稀释吹打混匀后，再加入其0.5倍体积的6wt％的羟乙基淀粉溶液，混匀后静 置30min，分离出上清，缓慢地将20ml上清液加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中，使 其与淋巴细胞分离液形成一个明显的分层，利用离心机进行离心分离，离心条件：4℃离心， 2100rpm，20min，升3降2，取中间白膜层并转移至新的50ml离心管中，4℃，2000rpm离心8 min，升8降8；弃上清液，所得细胞沉淀加入用40ml生理盐水吹打混匀，取 0.5ml细胞悬液用 于细胞计数计算细胞回收率，剩余细胞悬液利用离心机离心洗涤，离心条件：4℃，2000rpm 离心8min，升8降8，离心所得沉淀即为外周血单个核细胞； [0071] 3)CIK细胞的体外培养扩增：将收集的外周血单个核细胞接种于T175培养瓶中，加 GT‑T551 H3培养基，10％的自体血浆和终浓度为1000IU/ml的 IL‑2、80ng/mL抗CD3单克隆 7 7 CN 113445132 A 说明书 5/6页 6 抗体、800U/mL的IFN‑γ，使接种密度为1× 10个/ml，置于37℃、5％CO 、饱和湿度条件下培 2 养，此天设为第0d。CIK 细胞培养第3d，补加GT‑T551培养基、IL‑2以及终浓度为10％的自体 血浆。其中，IL‑2的补加量按新补充培养体系的体积计算。培养第5、7、9、11d充分吹打悬浮 细胞，收集计数，根据细胞密度补加与培养第3d相同的培养基及添加物。 [0072] 4)CIK细胞的检测：培养第12d，对CIK细胞进行支原体、细菌、内毒素、表型、细胞杀 伤能力、细胞活性等检测。 [0073] 8 5)CIK细胞冻存：检测合格后，于培养第14d收集全部细胞以10×10个/ml的密度 进行分装冻存，冻存液的配方为10wt％DMSO+(0‑10)wt％右旋糖苷+(80‑90)wt％人血白蛋 白； [0074] 6)编码入库：按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编码、制备培养冻存记录 和保存位置信息纸质版归档并统一输入计算机记录，用于管理和检索。 [0075] 实施例2 [0076] 一种人外周血CIK细胞库的构建方法，包括以下步骤： [0077] 1)采集健康供者外周血100ml至含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋中，无菌条件下转移 至50ml离心管中，利用离心机进行离心，离心条件：4℃，2500 rpm，10min，升1降1，取上层淡 黄色液体至新的50ml离心管中置于56℃水浴锅中灭活30min，利用离心机进行离心分离，离 心条件：4℃，3000 rpm，离心5min，升9降9，收集上清液，即为自体血浆，置于‑20℃冰箱备 用； [0078] 2)外周血单个核细胞的分离：将去除自体血浆后的下层红色液体按照体积量计用 生理盐水对倍稀释吹打混匀后，缓慢地将20ml混合液加入到含20ml 淋巴细胞分离液的离 心管中，使其与淋巴细胞分离液形成一个明显的分层，利用离心机进行离心分离，离心条 件：4℃离心，2100rpm，20min，升1降1，取中间白膜层并转移至新的50ml离心管中，4℃， 2000rpm离心5min，升9 降9；弃上清液，所得细胞沉淀加入用40ml生理盐水吹打混匀，取 0.5ml细胞悬液用于细胞计数计算细胞回收率，剩余细胞悬液利用离心机离心洗涤，离心条 件：4℃，2000rpm离心5min，升9降9，离心所得沉淀即为外周血单个核细胞； [0079] 3)CIK细胞的体外培养扩增：将收集的外周血单个核细胞接种于T175培养瓶中，补 加GT‑T551 H3培养基，10％的自体血浆和终浓度为1000IU/ml 的IL‑2、50ng/mL抗CD3单克 6 隆抗体、200U/mL的IFN‑γ，使接种密度为1 ×10个/ml，置于37℃、5％CO 、饱和湿度条件下 2 培养，此天设为第0d。CIK细胞培养第3d，补加GT‑T551培养基、IL‑2以及终浓度为10％的自 体血浆。其中，IL‑2的补加量按新补充培养体系的体积计算。培养第5、7、9、11 d充分吹打悬 浮细胞，收集计数，根据细胞密度补加与培养第3d相同的培养基及添加物。 [0080] 4)CIK细胞的检测：培养第12d，对CIK细胞进行支原体、细菌、内毒素、表型、细胞杀 伤能力、细胞活性等检测。 [0081] 8 5)CIK细胞冻存：检测合格后，于培养第14d收集全部细胞以10×10个/ml的密度 进行分装冻存，冻存液的配方为10wt％DMSO+5wt％右旋糖苷 +85wt％人血白蛋白； [0082] 6)编码入库：按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编码、制备培养冻存记录 和保存位置信息纸质版归档并统一输入计算机记录，用于管理和检索。 [0083] 以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也 只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术 8 8 CN 113445132 A 说明书 6/6页 人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相 似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。 9 9 CN 113445132 A 说明书附图 1/1页 图1 10 10
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