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8种特殊建库测序
今天呐，主要是给大家介绍一下RNA-seq（RNAsequencing)。也就是RNA的高通量测序技术。
因为我们这个节目主要是针对医学方面的技术进展，所以，我们今天对于RNA的介绍，也会侧重于人的RNA测序方面的技术介绍，以及相关的生物信息学方面的工作。
RNA高通量测序（RNA-sequencing,缩写为RNA-seq）是目前高通量测序技术中被用得最广的
一种技术，RNA-seq可以帮助我们了解：各种比较条件下，所有基因的表达情况的差异。
它可以检测的差异有：正常组织和肿瘤组织的之间的差异；它呐，也可以检测药物治疗前后，基因表达的差异；它呐还可以检测发育过程中，不同的发育阶段，不同的组织之间的基因表达差异。诸如此类呐，很多。我们不一一列举。
那么在所有检测的差异类型中，最常见的，就是检测所有mRNA的表达量的差异，这是最常用的一种检测。
同时呐，我们还可以检测 RNA 的结构上的差异。例如：mRNA的剪接方式的差异，也就是我们一般说的“可变剪接”，还可以检测“融合基因”，同时还可以检测基因单点突变导致的SNP（Single Nucleotide Polymorphisom)。
接下来，我们分成“RNA-seq测序方法”和“RNA-seq测序数据分析”两个部分，分别介绍RNA-seq。
在测mRNA的过程当中，首先要解决的问题，是如何去除核糖体RNA也就是去除“rRNA”(Ribosomal RNA)。
那在通常抽提到的总RNA中，绝大部分都是核糖体RNA（rRNA）。以人类的细胞或组织为例，一般抽提到的总RNA当中，95%都是核糖体RNA。剩下的2%到3%是mRNA。还有呐，2%到3%是Long non-coding RNA、或者tRNA、microRNA,这些RNA，也就是说mRNA只占了所有RNA中的一小部分。
如果我们把所有的RNA都拿来测序的话呐，测到的绝大部分的序列数据呐，都是核糖体RNA。而且这当中（rRNA）比例会高达95%左右，但是呐，核糖体RNA在整个人类当中都是非常保守的，而且在人的各个组织、器官当中也是极度稳定的。也就是说，测rRNA，它得到的数据，并不能为我们实验者提供什么有用的信息，而mRNA才是RNA当中信息含量最丰富的那个部分。
我们一般的RNA-seq要测的，也是mRNA的各种变化，所以呐，在实验过程当中，我们一般要把核糖体RNA先去掉。然后再进行建库测序。
今天呐，我们主要介绍一下应用最广泛的illumina公司的TruseqRNA建库方法。其它的方法呐，以后我们再找机会再给大家做介绍。
那么这张呐，就是mRNA测序的建库过程图。首先呐，是利用高等生物的mRNA都有Poly(A)尾巴这个特点，用带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交。然后呐，Poly(T)探针呐，就和带Poly(A)尾巴的mRNA结合在一起，接下来呐就回收磁珠，然后呐把这些带Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
然后呐，再把这些洗脱下来的mRNA用镁离子溶液进行处理。镁离子溶液会把mRNA打断。
逆转录成（第一链）cDNA后，再合成出第二链（cDNA)。这样就成为双链的cDNA。接下来呐，我们再在双链的cDNA的两端接上“Y”型的接头。这样呐，就成了标准的测序文库，然后呐，这个标准的测序文库就可以拿到HiSeq测序仪上进行测序了。
在这里呐要说明一下，这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。
这是因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是Poly(A)的那些序列。那么如果mRNA发生了降解，也就是mRNA断掉了，那么磁珠所吸附下来的片段，都是那些靠近3端的那些断片，而那些5端的断片呢，是吸附不下来的。会在富集过程中被洗脱掉。
那么为了保证能够测到尽可能完整的mRNA序列呢，Illumina公司是这样建议的：它建议先对总RNA进行一次质量检测，一般是用Agilent公司出品的Bioanalyzer 2100毛细管电泳仪，对总RNA样本进行一次电泳质检。那Bioanalyzer呐会根据18S和28S这两个核糖体RNA的电泳峰是否高、是否尖，来判断RNA的质量。并且呐，会自动打分。
这两个峰越高、越尖，也就说明RNA的降解就越少，完整度呐就越高。那么打分呐，也会越高。反之呐，打分就会低。这个分值呐，叫“RIN”值。也就是RNA的完整度评分值。是“RNA Integrity Number”的英文首字母缩写。RIN值最高是10分，最低呐是0分。
Illumina公司推荐用RIN值在8.0以上的RNA进行建库和测序。测序完成之后呐，就可以进行数据分析了。
分析的第一步呐，一般是先把测到的RNA片段，先mapping(比对)到基因组上，那么在比对完了之后呐，可以先看一下，有多少的RNA片段，是在靠近基因的5端的位置，又有多少片段在是靠近基因的3端的位置。
那么这张图上呐，就是把所有的基因，都按其外显子的长度呐，拉直，然后呐，归一化到“0 - 100”的这样一个长度。然后呐来看，比对上的片段，有多少是落在这0到100的这一个轴的哪个位置上。
这样一个比对的结果，就可以让我们看见前面Poly(T)磁珠在抓mRNA的时侯。
捕获下来的这些mRNA是不是完整的，如果捕获下来的这些mRNA大部分是完整的线端的曲线就会显得比较饱满。它的高度会和3端的高度差不多。
反之，如果这根曲线端是比较低的，我们就可以初步判断，这个RNA有一定程度的降解。
因此，我们可以推断在捕获过程当中，有相当一部分（mRNA），它的5片段因为与3片段的Poly(A)片段的尾巴断开了，所以，没有被捕获下来。所以，这个RNA呐，是有一定程度降解的。
在知道了测序的质量之后呐，接下大家来要关注的就是不同样本之间、各个基因的mRNA的表达量的差异。
RPKM翻译成中文呐，就是每一百万条可以比对到基因组上的Read当中，有几条是可以比对到某个特定基因的，
它的分子呐，就是经对到某个基因的外显子的read数。它的分母的第一项呐，就是这次所有比对到基因组上的read数（M reads，MillionReads）。分母的第二项，就是这个特定基因的外显子的长度。
我们接下来分步地对这个公式进行一下解释，首先呐，就是比对到某个基因的外显子上
的Read数，去除以这次所测到的、全部可以比对到基因组上的Read数。这个比较容易理解就是：这个基因所表达出来的mRNA,它所被测到的片段，来和所有被测到的、可以Mapping(比对）到基因组上的片段来进行比较。这点是比较容易理解的。
那么这个比较费解的是，为什么还要除以第二项，就是“除以这个外显子的长度”。这是因为建库过程当中，这个RNA是用镁离子溶液来处理，
然后打断（并逆录）成若干个180-200BP左右的小片段，如果一个基因的长显子越长，那么它所产生的mRNA就越长，那么mRNA越长呐，被打出来的小片段就越多。
我们来假设，一个A基因，它的mRNA的长度呐，假设它是1Kb，那么它的1Kb的mRNA可能被打成“5”个，200Bp左右的小片段；那么还有一个B基因，如果这个B基因的mRNA是2Kb长，那么，它同样被打成200Bp左右的小片段呐，它就会产生“10”个小片段。
我们来看，A基因是5个小片段，而B基因是整整10个小片段，所以，B基因在测序过程当中，它被测到的概率就会比A基因整整大出去一倍。
这就是我们为什么要把刚才第一项比出来的比值呐，然后再除以这个外显子的长度。
通过上面的解释呐，我们就可以理解：除以这个外显子的长度，它的目的：是修正这个mRNA长度所引起的mRNA的Read数的偏差。
那么作为一种针对全转录组的分析，我们希望是一次看到一个整体的样本（表达）差异的情况。而不仅仅是看少数几个基因的表达差异。
科学家做了一种叫“火山图”的一个图形，来比较形象地来说明2个样本之间的表达差异。
那么我们来看这张图，这张图呐，这个样子就象火山喷发的样子，那么这个图呐，是2个样本的RNA的表达量的对比。
纵轴是表示这种差异的置信程度，这其中的每个点呐，就是两个样本当中同一个基因的mRNA表达量的变化。
如果这个基因的表达是上调了，那么这个点呐，就往右移动。反之，如果这个基因的表达量是下调了，那么这个点呐，就往原点的左移动。
那么这个纵轴呐，就是这种变化差异的置信程度。如果这个置信程度越高呐，那么这个点的纵轴位置也越高。
那么我们在纵轴上划了这样一条水平线，超过这个水平线以上的（点）呐，（其差异水平的）置信程度是很高的。我们就把它标示成红颜色。如果低于（这条水平线的）置信程度呐，它的置信程度也相对低一些，我们把它标成蓝颜色。
这里要解释一下，为什么差异程度是相同的情况下，它们的差异置信程度是不一样的。比如说同样是差了2的5次方，也就是32倍，它的差异置信程度会不一样，有些是蓝点，有些是红点。
A基因在甲样本中，被测到了3200条，而在乙样本中被测到了100条；B基因在甲样本中，被测到了320条，而在乙样本中被测到了10条。它们同样是差了31倍，但是因为A基因的样本统计数，远大于B基因的样本统计数，也就是说，它们的Reads数有那么大的差距。
所以，A基因的这个差异的置信程度，会比B基因的这个差异置信程度要高许多。
那么，我们再来对比这两张图。那么就可以比较直观地发觉，左侧的这个图当中，有更多的基因表现出明显的差异，这样呐，火山图就为我们提供了一个形象的、直观的、整体表达差异信息。
聚类分析呐，是RNA分析中非常常用的一个手段。它呐是通过多个样本的全基因表达谱对比，
这是一张聚类分析的图，横轴呐是样本，纵轴呐是基因。通过聚类分析呐，可以发现：在这个群体中，样本被分成了3个群体。
每个群体的内部呐，都有着相似的表达特征。同时，我们还可以看到，基因的表达，也是成簇的，这儿呐大体上分成3个基因群。那么这3个基因群呐，各自有着相似的表达量。
那么还可以通过对多个基因在特定疾病当中的表达倾向性呐，来找出可能的、新的、诊断用的Biomark。
GO分析是RNA-seq分析中非常常用的一种分析。GO是Gene Ontology的缩写，GeneOntology呐是一个国际化的、基因功能分类体系。这个体系用一整套动态更新的标准词汇、和严格定义的概念，来全面地概括任何生物中基因和基因产物的属性。
差异基因GO富集柱状图：可以直观的反映出在生物过程、细胞组分、和分子功能富集的差异基因的个数分布情况。
有向无环图，是差异基因GO富集分析的图形化展示方式，从上到下呐，它所定义的功能范围越来越小、越来越精准。
它的分支呐，表示包含关系。而这个圈圈的颜色越深呐，表示这个富集关系程度越高。
通路分析：通路（Pathway）是指在系统水平上完成生物的某一功能的基本单元、或者局部子网络。
KEGG，也就是：Kyoto Encyclopaedia of Genes andGenomes。翻成中文：就是《京都基因和基因组百科全书》，是目前公认的、最权威的基因功能数据库。
目前针对Pathway的分析、注释，大多数是基于KEGGPathway来做的。
在此图中，KEGG富集程度通过Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因个数来衡量。
qValue呐，是校正之后的pValue。那么它越接近于0呐，表示富集程度越显著。
接下来呐，我们要说一下，RNA-seq当中，可以测到的mRNA上的各种结构上的变异。
这里要说明一下，对于想要测mRNA结构变异的用户呢，建议测序深度要测比较深。
我们一般呐是建议测10G以上的数据量。那么为什么要测这么多的数据量呐？原因是二代测序，目前的测长还不是很长，每一个Read呐，只有大约100到125个Bp左右。如果测序深度不够呐，那么读到的这些read在整个的mRNA上的分布呐，是一种比较零碎的一种状态。
那么在这种比较零碎的、不完整的覆盖情况下，要去分析哪里有一个剪接点，哪里有一个断点，哪里有一个SNP，它不是很准确的。
当测序深度足够深的时侯，在每一个位点，都有10几次、或者几10次的覆盖的时侯呐，我们就可以比较有把握地来判断出，哪儿有了一个新的剪接点，哪儿出现了一个断点，哪儿，碱基发生了突变。
可变剪接，在真核生物中普通存在。一般一个人的组织样本当中呐，可以通过高通量测序，发现有5000个到20000个左右的可变剪接。
融合基因呐，是指原来在基因组上分开的2个基因，因为某种原因，染色体发生了重排。
重排的结果呐，是让A基因的头，接到了B基因的身体上，这样就产生了融合基因。
接下来这张图呐，是高通量测序测到融合基因的这个图。我们可以看到这10几个Reads都横跨在这个融合基因的、交接点的两侧，由此呐，证明了这个癌细胞当中有这么一个融合基因。
RNA-seq呐，还可以找出点突变，这个呐，是一张泡泡图，来表示我们所找到的点突变。
发生突变频率最高的这个基因，就用最大的泡泡来表示。（突变）频率低一点的，就画一个小一点的泡泡（频率），再小一点，那么再小一点的泡泡。
今天，我们会和大家谈一下人外显子组测序的方法原理。和它能够给我们带来哪些有用的生物信息。
那我们还是分两个部分来介绍，第一个部分呐，介绍外显子测序的技术方法。第二个部分，我们来介绍外显子测序可以得到哪些有用的生物信息。
我们先来看这张图，外显子测序的核心技术呐，是这（些）个针对人外显子序列设计的捕获探针库，那么这些探针的序列呐，都和人外显子的DNA序列相互补。
在实验过程中呐，它可和人的外显子DNA序列进行杂交结合。同时呐，这些探针都标上了生物素。
杂交过程中，通过核酸序列的互补结合的原理，探针会和目标DNA片段进行结合。
一般用Agilent SureSelect 50M的试剂盒进行外显子建库、捕获。再用HiSeq 2500 V4 PE125的方法进行测序，测10个G的数据量。大约可以得到95X的“有效测序深度”。我们说的有效测序深度（effective sequencing depth）是相对于总测序深度来说的。
举例来说，用Agilent 50M的这个试剂盒，我们测到10个G的数据。
去除以目标区域的50M的大小，那么得到的是200X的测序深度（10G/50M = 200X）。
但是这个200X的测序深度，对于做生物信息学分析来说呐，并没有太大的实在意义。
第一个影响因素呐，就是因为杂交捕获的过程它不是十分精确的，基因组中的有许多序列，
是和外显子有一定的同源性的。那么这些片段呐，在杂交过程当中，也会被杂交捕获下来。而这些片段呐，不是基因的外显子。
第二个影响因素呐，是捕获下来的一个片段，很可能它(只有）一部分的序列是落在目标区域还有一部分序列呐，是突出在目标范围之外的。那么，这部分突出来的序列呐，它不是目标区域，所以，它也不计入外显子测序的“有效测序深度”。
这个落在目标区的数据，占全部被测到的数据的比例，我们用一个专业术语来称乎它，叫作
第3个影响有效数据比例的因素呐，是Duplication。那么所谓duplication呐，就是建库过程当中它的最后一步，是通过PCR扩增把原始的模板，扩增出几百倍来。那么由同一个模板分子扩增出来的子文库分子呐，是长得一模一样的那么这些多出来的这些分子，如果被重复地测到它并不能为我们提供太多有用的生物信息。所以，我们在生物信息分析的过程当中，
那么要去掉这些重复的片段我们判断的依据是：2个DNA分子它们的5起始位置、和3的结束位置，完全一模一样，那么我们就认定这2个分子，是从同一个母分子，PCR出来的（2个）子分子。
然后呐，我们会比较这2个序列的数据质量，留下那个数据质量比较高的，去掉那个
数据质量比较低的，这也就是我们通常所说的“去Duplication的过程。
那么，我们说明一下，duplication的比例不是恒定不变的。而是会随着测序深度的增加、而增加，因为上机（测序）的文库是经过PCR扩增的文库。
随着测序量增大，那么测到源自同一个模板的PCR子分子的概率呐，就会提高。
第4个影响因素呐，是目前主流的测序方法是HiSeq V4 PE125这种方法。也就是：双端各测125个碱基，那么Agilent的建库方法中当呐，插入片段是150~200BP，这样一个大致范围的这些片段，那么它的平均片段长度呐，是180BP。那么我们用双端125的方法来测序就会导致左边的这个reads（序列）和右边的这个reads（序列），读到当中，会有一段，大概会有70BP的交叠。
那这个70BP的交叠的序列，是冗余的序列。也就是说，我们读了250个BP的序列，但是
除了测到的有效数据量之外，还有一个因素会影响到后面的分析，这就是Reads的分布均匀情况，也就是说目标区域的每个碱基被覆盖的深度的均匀性。那么这个结果呐，是越均匀越好。
科学家经过实测，发现Agilent的SureSelect、和Roche的Nimblegen，这两个捕获试剂盒，所得到的覆盖均匀性是比较好的。
外显子测序，可以测Germline突变（胚胎形成时就带有的突变），也可以测体细胞突变（Somatic Mutation），但是呐，随着Illumina推出HiSeq X10测序仪，把人全基因组测序的直接成本降到1000美元以下，那么Germline水平的突变呐，已经很少用外显子来测了。
目前，外显子测序的主要优势就体现在肿瘤基因测序方面，之所以外显子测序在肿瘤基因测序方面有优势呐，这是因为外显子测序，它的测序深度，可以比较容易地做到“深度”测序。那么呐，它可以比较轻易地达到100X、200X，甚至更深的测序深度。这个呐，就有利于测到low allele frequency （低等位基因频名优新）的体细胞突变。
因为肿瘤中的突变呐，往往都是 low allele frequency 的体细胞突变。所以，外显子组测序就在测肿瘤基因组突变方面，显出比较明显的优势来。
那么如果是要测肿瘤中的体细胞突变呐，一般是拿手术切下来的肿瘤组织DNA、和病人外周血中的白细胞基因组DNA，进行外显子测序。
一般肿瘤的测100~200X的深度，白细胞的（DNA）测100X的深度。从白细胞DNA得到这个病人的Germline基因组序列，拿肿瘤的DNA序列与之做对比，找出其中的体细胞突变。
外显子组测序，主要能够得到的信息是点突变，也就是SNP信息，和插入缺失突变，也就是Indel信息。这张图呐，就是找到的体细胞突变的泡泡图。
在这个泡泡图中，突变频率越高的基因，就画一个大泡泡，放在图的中间。突变频率低一点的基因，就画一个相对小一点的泡泡，延着逆时针排列。再低频的突变，再画一个再小的泡泡，再在外面再排列下去。依此类推，就得到这样一个泡泡图。
关于GO和Pathway的定义，我们已经在前一期讲RNA-seq的节目当中，给大家介绍过了，想要了解的朋友可以在优酷中找一下：【陈巍学基因】视频7：《RNA-seq方法和应用》这一集。自己去看一下。
这个图中，是越向下，它的功能就划分得越精细。同时颜色越深的块块，则表示突变在
这是Pathway的KEGG富集分析。它吶，可以帮助我们看到哪些通路发生了显著的变化。
更深一步的分解分析，则让我们深入地看到突变的基因在整个通路中所处的节点。
让我们更好地探索突变和病变之间的关系，我们要说明：在外显子测序的数据分析当中，对基因组的结构变异是不敏感的。
不敏感的原因是外显子测序，只测了基因组上很小一部分区域，这个比例小到了只有1~2%
，所以当结构变异的断点，不落在外显子区域的时侯呐，外显子测序是看不到这些断点的，所以我们说：外显子测序对基因组的结构，变异--SV（Structure Variation）呐，是不敏感的。
外显子测序对拷贝数变异（CNV，copy numbervariation），不是很敏感。不敏感的原因呐，是因为杂交捕获过程啊，是一个含了很高偶然性的过程。
也就是说，一个外显子片段上，它有多少个reads(序列)被捕获下来，样本和样本之间是有很大差异的。
我们很难判断，是因为这种偶然性呐，还是因为拷贝数发生了变异。所以，外显子测序，对于小片段的拷贝数变异，它本身是不敏感的。
但是，如果基因组上发生了大片段的拷贝数变异。比如说，长度在5M(5M base pair)以上的
片段发生了拷贝数变异。那么外显子测序呐，是可以发现的，这是因为这样长的片段当中呐，一般含有多个外显子。当多个外显子的测序Reads数都发生了改变，那么，它就会有统计上的显著性。通过这种统计上的显著性，我们可以来判断：基因组上的确发生了拷贝数变异。
因为外显子组测序对结构变异和拷贝数变异不敏感，所以，在实际的肿瘤基因测序中呐，科学家往往是这样做的：用全基因测序来找到肿瘤样本中的结构，变异（SV）和拷贝数变异（CNV），再用来外显子组测序来找肿瘤样本中的、低频的SNP和Indel体细胞突变。
今天，我们在讲外显子组测序的同时呐。我们就顺带说一下针对某些疾病所设计的捕获Panel测序，所谓Panel，往往是指对若干个基因设计一个捕获试剂盒。
这一类的Panel，它的建库、捕获、和测序原理，与外显子组测序是完全一样的。
但是因为它所选择的基因数远少于外显子，所以就可以用较少的测序量得到非常深的测序深度。
同时因为测序数据量较小，所以数据分析的难度也会小许多，耗时也会更短。这对于临床诊断所需的快速响应呐，是有十分多的好处。
今天要给大家介绍的是：small RNA-seq，也就是“小RNA的测序”。
那么，小RNA呢，包括了micro RNA/tRNA/piRNA等一系列的、片段比较短的RNA。其中，micro RNA因为其基因数量众多，同时，表达量变化丰富，是近10年来的一个研究重点，我们今天分2部分来介绍samll RNA测序。
在small RNA的结构上，都是5’端有一个磷酸基团，在3’端有一个羟基基团。
在建库过程中，先在它的3端连上一个3端专用的接头。然后，再在5端连上一个5端专用接头。
所以，一般情况下，这个文库还要经过进一步的电泳胶分离。切胶回收，才能得到比较纯的、我们要的small RNA文库。
关于RIN值（RNA Integraty number,RNA完整度值）的意义，如果观众有不清楚的，又想要了解的，可以在优酷视频当中找一下【陈巍学基因】《视频7：RNA-seq》，里面有专门的介绍。
一般情况下，人源组织所测到的small RNA会在22BP左右有一个主峰。这个主峰就是micro RNA，同时，30BP左右又会有一个副峰，这个峰，主要是piRNA。
在参考基因组上比对好之后，就可以把这些序列和已知的small RNA数据库进行比对了。
比较有名的small RNA数据库是miRBase，这个数据库目前这个数据库已经收录了2000多条人源的micro RNA基因。
在对人源样本的测序过程当中，大家最关心的主要是micro RNA和piRNA，这2种small RNA。那么在测序过程当中，实际上还会测到rRNA的碎片和tRNA的序列。
因为rRNA和tRNA在人的基因组中是十分保守的，所以一般不是我们关注的重点。
图中，横轴是一个small RNA基因的表达量。越向右呢，则这个基因的表达量越高。纵轴是有特定表达量的基因数量，越向上，则基因数目越多。
从这张图上可以看出，少量的基因有高表达，大多数基因的表达量，还是相对偏低的。
火山图的横座标，是某个small RNA基因的表达的增减。从0向右，则表达量上升，从0向左，则表达量下降。纵轴则是表达量差异的显著性，越向上，则差异越显著。
一张火山图，可以让我们轻松地观察2个，样本之间，small RNA的表达差异。
聚类分析，则可以帮助我们直观地观察，一批样本当中，那些样本有共同的表达特征。又有哪些small RNA基因有相似、相近的表达量。
如这张图中所展示，样本经过聚类分析，明显地可以看出，其small RNA的表达谱，呈现2种表达情况，上绿下红的样本呢，自然地被分到了一组，上红下绿的样本呢，就会被自然地分到另外一组。
在人类细胞中micro RNA主要是通过和mRNA结合，来阻止mRNA翻译成蛋白，从而起到抑制靶基因表达的作用。目前，只有少数的micro RNA和靶基因mRNA的对应关系是经过了实验验证的。大多数还是通过序列互补、结合热稳定性等预测性手段来预测的。
所以，这些关系不是很精确的。虽然这种预测不是很精确，但是它能为我们的科研提示有用的研究目标。
接下来，我们说一下micro RNA侯选靶基因的GO分析、和KEGG Pathway(通路）分析。
想要了解这2种分析的基本情况的同学，可以在优酷中找一下【陈巍学基因】《视频7：RNA-seq》去看一下。
通过GO分析，表达差异被富集到分类的GO的子项目当中，通过这个图，可以看到“生物过程”、“分子功能”、和“细胞组件”的哪些环节出现了明显的差异。柱子越高，则表示差异越明显。
在这个图当中，越向下，功能就越是细分。同时，颜色越深的方块呢，则表示差异在这个小概念当中，富集程度越高。通过对表达差异的micro RNA和它对应的靶基因进行KEGG分析，
这个图，就是KEGG分析的结果。在此图中，KEGG富集的程度，通过富集因子、Qvalue、和富集到此通路上的基因个数，来进行衡量。
它可以让我们看到，在一个整体的通路中，具体是哪个、或哪几个节点会有显著的差异。
寻找到新的micro RNA基因。一般是测序测到新的、有发夹结构的microRNA前体的序列，同时测到对应的成熟的micro RNA序列，并且在基因组上又找到了对应的基因序列，这样，大体上就判断（可能是）找到了一个新的micro RNA基因了。
随着技术的持续进步，目前用血清、或者血浆中的micro RNA来诊断疾病，成为诊断医学十分关注的一个研究方向。这是因为：
1) 血清当中有大量的、种类丰富的micro RNA。并且这些micro RNA可以相对稳定地存在
4) 而且，目前血清、或者血浆中的micro RNA已经可以被方便地测到
所以，许多学者都在研究血清micro RNA，以期望从中找到新的诊断Biomarker。
目前，做一个血清micro RNA测序，大约只需要0.5毫升左右的血清、或者血浆。
用于micro RNA测序用的血清、或血浆，可以用3倍体积的Trizol LS来进行保存。也就是说，0.5毫升的血清，加上1.5毫升的Trizol LS。混合均匀之后呢，-20℃、或-80℃保存。然后，通过干冰运输，交给专业的测序公司，就可以进行测序、分析了。
自从二代测序技术出现，把一次实验测许多条DNA序列的这个难题解决之后，一次把一个人的全基因组给测出来，最极限的情况，就是样本量就是少到一个细胞，就要测出整个基因组的序列信息。
第1个，就是如何实现均匀扩增，也就是说，用传统的随机引物PCR的方法来扩增。那么不同扩增片段的扩增效率多少会有一些差异，这些扩增效率的差异会随着扩增循环数的增加，呈现出指数放大的效果。其结果就是会发生严重的覆盖不均一，极少数区段的DNA被大量扩增，测序后它深度非常深，但在大多数区段只有很低的覆盖，甚至没有覆盖。那么我们就无法有效地判断那些低扩增效率区段的基因序列的情况。
那么它的第2个难题，就是全基因组覆盖问题。常规的、用大量DNA进行建库的方法，因为打断、补平、加A、加接头等一长串的操作，每一步都会有DNA片段的损失。结果就是初始DNA中很大一部分会被浪费掉，而没有形成有效的文库分子。
在单细胞测序中，丢失大部分的起始DNA，是不可接受的。单细胞测序要求几乎所有的原始基因组片段都得到扩增，并且在后续的测序过程中被测序测到。这就要求几乎所有的片段，都会被得到扩增，而不只是少数片段得到有效扩增。
第3个难题，是这种方法要有较高的扩增效率。建好的文库，在HiSeq测序仪上机的时侯，大约每上机2万个文库分子，只有1个文库分子，是能够在测序的Flowcell表面生成簇，并且被测序测到的，剩下的大多数文库分子，在上机的时侯是被水冲走的。所以，单细胞基因组扩增的方法，还要有较高的扩增效率。至少要有上万倍到几十万倍的扩增效率，才能保证在全基因组测序的时侯，大部分的片段都被测序测到。
这张图是MALBAC方法的示意图。这个黑色的线条，就是基因组模板DNA，这些红颜色的线条就是扩增引物，扩增引物的5’端有27个碱基的通用序列，这些通用序列会作为未来的PCR通用扩增引物的结合序列。扩增引物的3’端有8个随机序列的碱基，这8个碱基可以随机地杂交到基因组DNA的互补序列上。
这些灰色的椭园是Phi 29 DNA聚合酶，Phi 29 DNA聚合酶有一个特点，它不仅可以生成新的DNA链，它还能把之前已经合成好的DNA链给解链开。
再形成自己的新链，这个特点能够把每个循环所能合成的DNA新链的数量提高几倍、甚至几十倍、上百倍。
接下来，就是做5个MALBAC循环，请注意，这里每个循环的最后一步是58度退火。我们后面要详细解释这一步58度退火的作用。
在第二个循环完成后，所产生的扩增产物中，大部分是5’端有通用序列。而3’端，有与通用序列互补的序列的这些片段。
图中的这4个步骤，一共重复5次，这样做的巧妙之处，就是要解决我们刚才所说的3个难题。
刚才，这个MALBAC方法的巧妙之处，就是在每个循环的最后，加了一步58度退火，这一退火过程，它让完整扩增的产物，它的两端发生链内杂交。这样，3’端的序列就不能与新的、游离的引物发生杂交。这也就不会引新的、发起始于3’端的扩增，这样，就避免了完整扩整的产物的自我指数扩增。
现在，还是8个随机序列的引物在模板上随机地找结合位置，所有的位点都有一样的机会被扩增。
第1种，就是m* n 个“完整扩增产物”，这是最主要的产物。这里“m”就是循环的次数， “n”是一个循环中，有多少个扩增，引物可以粘到一个模板上。
第2种扩增产物，就是(m+1)* n个“半扩增产物”，第3种DNA，就是那个原始的DNA模板，这里完整产物的数量是“m*n ”，也就是说，扩增产物（的数量）与扩增的循环次数“m”成正比，而不是与m的平方成正比。更不是与2 的M次方成正比。
这也就是达到了，我们想要的“线性扩增”的目的。也就是说扩增产物（的数量）与扩增的次数成线性关系。这就达成了我们单细胞测序当中第1个要求“线个要解决的难题，就是“全基因组覆盖”
这里，是利用Phi 29聚合酶的能一次在模板上聚合出多个新链的功能来达到这个目的。
在5轮的扩增之后，每个模板都会有5*n^2个扩增片段。这样，就可以保证建库时大多数的
第3个要解决的问题“高效率扩增”。还是利用了这个Phi 29酶的一次得到多个扩增片段的这个效果，来达成的。
Phi 29酶的特点是，它可以把双链DNA进行解链，然后，在常温条件下，就把原始模板进行大量扩增。
MALBAC方法的特点，在于它的扩增均一性更好。但是，它得到的扩增DNA量相对较少，或者说，它的扩增效率相对比较低。
这张图是：大量细胞测序、MDA方法测序、MALBAC方法测序，这三种测序结果的Lorenz曲线。
Lorenz曲线是越接近于对角线，则覆盖越均一，从图中，我们可以看出大量细胞测序，它的均一性是最好的。
用MALBAC方法测序，它的均一性比大量细胞测序的均一性要差一些，但是要比MDA的方法的均一度要好。
这张图是用三种方法来测肿瘤细胞中的拷贝数变异。其中横轴是染色体的序列，纵轴是测序的覆盖深度，可以明显地看到，在大量细胞测序的结果中，可以非常直观地看到拷贝数变异的情况。
而用MALBAC的方法，也还是能够比较清楚地看到拷贝数变异。但是，它没有大量细胞测序的结果那么清楚。
在这里我们介绍一下，单细胞测序在胚胎植入前检测中的应用，在有习惯性流产的夫妇当中，最常见的病因就是染色体的平衡易位，所谓染色体平衡易位，也就是A染色体，的一段移到了B染色体上。
如果夫妻一方有染色体平衡易位，那么这对夫妇的受精卵中，每4个受精卵，可能只有1个是正常的。剩下3个（不正常的受精卵），很可能会流产。
要把这一个正常的受精卵挑出来，目前，最有效的解决手段是做受精卵植入前检测。
在这个测序过程当中，就要用到MDA方法或MALBAC方法进行扩增、建库、测序。
然后测序完成之后，挑出那个好的受精卵，植回到母亲的子宫中去。长成一个正常的新生儿。
单细胞mRNA测序一直是科学家关注的一个热点。目前市场主要有2种建库方法，分别是Clontech公司推出的SMART法，和EpiCentre公司推出的TargetAmp方法。
第一个难题就是一个人类细胞当中，它的总RNA量大约只有10pg左右（1pg=10^-12g）,中的mRNA的量大约只有0.2个pg。要把那么少的mRNA转变成约零点几个μg（1μg=10^-6g）以上的核酸文库，这意味着核酸的扩增量要达到几百万倍以上。
PCR偏差会随着PCR循环的次数的增多而指数放大。那么，在这种情况下，一方面要把核酸扩增几百万倍，甚至更多的倍数；另一方面，又想得到均一覆盖的文库，这就是单细胞mRNA建库当中，所要解决的第一个大难题。
第二个难题是如何能尽可能高效地得到“mRNA”的文库，而不是含了大量“rRNA”序列的文库。因为rRNA在总RNA当中占了95%，甚至更高的比例，而mRNA在总RNA当中只占2~3%的比例。如果不加区分地进行逆转录，再扩增、建库很可能测序得到的绝大部分序列都是rRNA的序列。
但是 rRNA序列不能给我们带来有效的生物信息，它是无用的。而只有测到mRNA的序列，才是我们想要的信息，这样，如何能够选择性地把mRNA转化成测序文库，并且避免把rRNA带到测序文库中来，这就是单细胞mRNA测序当中，要解决的第二个大难题。
接下来，我们就来介绍SMART方法和TargetAmp方法，是分别如何解决上述2个大难题的。
SMART方法最核心的技术，就是设计了2个特殊的引物。再配合用MMLV逆转录酶进行逆转录。
我们先来看这个逆转录的起始引物。它哪，先是一段通用序列，未来这个通用序列会用作PCR扩增的引物识别序列，中间是一长串的T，这些T是专门识别mRNA的3’末端的Poly(A)尾巴序列。它会和这些Poly(A)尾巴互补结合，引物的最末端有一个定位的结构，这个定位的结构，就是在它的3’末端的倒数第2个碱基是一个
。引物的这个末端结构，就是让它正好结合在mRNA的3’端连到Poly(A)尾巴的这个连接处，而不会结合到mRNA的别的地方。这样就保证了逆转录的起始位置正好是mRNA的3’端的序列终止位置。
我们再来看这个MMLV逆转录酶，这个酶有个特点，就是它在转录到mRNA的5’端末端的时侯，会在新合成的cDNA的3’末端，多加出几个C碱基来。
再接下来，这个上游引物会发挥它的作用。这个上游引物，它有一个特点，它的3’端是3个非脱氧的G碱基，也就是核糖核酸的、RNA的G碱基，而不是DNA的G碱基，这个引物可以与刚才新合成的cDNA的3’端的那几个C碱基发生互补杂交，然后引导这个MMLV酶再次发挥聚合作用，以刚才那条新合成的cDNA为模板，复制的结果，就是得到双链的cDNA。
这个双链cDNA，两端都已经接好了我们人工设计的PCR引物序列，然后，就加入常规的PCR引物，进行常规的PCR扩增，常规PCR扩增，得到大量DNA。然后可以象常规的DNA建库那样，超声打断、建库、上机测序了。
第1点，是先用一个定位引物，保证cDNA的合成是从mRNA的3’最末端开始的，同时让合成出的cDNA在下游连上了一个通用PCR序列。
第2点，是利用MMLV逆转录酶会在新合成的cDNA的3端，多加上几个C碱基的特点，再用有3个G碱基的上游引物进行第二链的合成。这就保证只有完整的第一链cDNA也就是那些带多个“C”的cDNA（第一链）才能被合成出cDNA的第二链，这也就保证了双链cDNA是全长的cDNA。
第3点，就是要保证PCR扩增的效率的一致性那我们知道，PCR扩增效率的最主要的影响因素是引物的序列，现在因为cDNA的5’端和3’端的都分别引入了统一的引物序，所以，这就去除了因为引物序列的不同。而引起PCR效率不同的，这个最主要的偏差因素。这也就在较大程度上保证了PCR扩增效率的一致性，减少了PCR偏差。
用SMART方法，对于1个细胞，也就是10pg总RNA的RNA进行建库测序，RPKM为10的这些基因，有60%是被测序测到的；对RPKM为100的基因，有90%可以被测序测到。而且被测到的几率，波动很小。这说明SMART方法是一个有效的单细胞mRNA测序方法。
接下来，我们介绍第2个单细胞mRNA建库的方法--TargetAmp方法
首先是用T7-Oligo(dT)的引物进行cDNA合成。这个引物，在5’端有设计了一个T7启动子序列。3’端是多个的T碱基，这一串T碱基可与mRNA的poly(A)尾巴相结合，作为逆转录的起始引物，经过逆转录，得到第一链的cDNA。同时这条cDNA链上，被引入了一个T7启动子。
然后用RNase H酶把cDNA:RNA双链产物中的这个RNA链消化掉，接着再合成出第二条cDNA链来，这个双链的cDNA就可以作为转录的模板。利用链上的T7启动子，转录出大量的反义RNA来（antisense-RNA，aRNA）。
接着，将这些反义RNA进行纯化。再用随机引物进行逆转录，得到第二轮的cDNA，接着，再用T7-Oligo(dT)这个引物，粘到第二轮的cDNA的Poly(A)尾巴上，再合成出双链DNA来。
这个双链的cDNA再经过第二轮的转录，又得到第二轮的反义RNA，这些第二轮的反义RNA的量，足可以达到微克级。再经过一轮逆转录，就可以得到几个微克的cDNA。那么几个微克的cDNA，就足以进行建库、测序之用了。
。因为扩增那么多（倍）的核酸，如果用PCR，要用几十个循环，那么PCR不同的扩增子的扩增效率，即使一开始是很小的差异，也会在几十个循环中，被指数放大，变成一个很大的差异。那么TargetAmp方法用转录的办法，
它的每一轮转录，都把核酸的量扩大几千倍。经过这样两轮的扩增，就把核酸的量扩大了几百万倍。这样，一方面它得到了高达几微克的核酸。足够用于建库，同时又避免了PCR过程，也就避免了PCR扩增偏差
随着高通量测序的费用不断地降低，它正变成科研中越来越普及的研究手段。相信有更多单细胞mRNA建库方法，和更新的技术应用会不断地被开发出来
DNA的甲基化是在DNA的序列不变的条件下，在其中某些碱基上加上甲基的这样一个过程。
这个（甲基化）分析方法当中的核心化学反应，是用亚硫酸氢盐来处理DNA。DNA当中，没有甲基化或羟甲基化的C碱基，就会被转化成U碱基。
我们来看这个转化的过程，在弱酸性条件下，亚硫酸氢根会结合到没有甲基化的C碱基的6位。而甲基化了的C碱基不会和亚硫酸氢根发生这个反应的。
然后，用碱来处理。结合了亚硫酸氢根的非甲基化的C，就被脱氨基，并且脱亚硫酸根。然后，就被转化成U碱基。
那么，甲基化或者羟甲基化的C碱基，因为之前没有和亚硫酸氢根起反应，所以现在用碱来处理，它也不会发生脱氨基反应。所以，它还保持了是“C”。
它的优点，就可以让我们接下来通过高通量测序的方法，可以精确地看到单个碱基的甲基化的水平。
经过亚硫酸氢盐转化过的DNA，再经过PCR，PCR新合成出来的链，U碱基的位置，就会被替换成了“T”。那么在接下来的测序过程中，测到的也是T碱基。
而甲基化的C，因为没有被亚硫酸氢盐所转化，所以，在接下来的测序过程中，被测到的，还是“C”碱基。
先说第一种，用Illumina公司的Truseq DNA建库方法，来做甲基化测序。
因为Illumina Truseq DNA建库试剂盒当中，它所提供的接头，那么这个接头上的C碱基都是已经经过甲基化修饰了。
所以，用这些接头做出来的文库，在用亚硫酸氢盐做转化的过程当中，它的（接头上的）C还是保持是C，不会被转成U。
带了这些接头的文库分子，就可以和测序芯片上的草皮DNA发生互补杂交。并且进一步发生桥式PCR反应。生成测序用的DNA的簇（Cluster）。
，就是在用亚硫酸氢盐处理DNA文库的时侯，90%以上的DNA链会断掉。这样，已经建好的文库，其中90%分子会被破坏掉。也就是说文库的丰富度就会损失90%以上。那么，相应的它有它的好处，它的好处就是，在这个建库过程当中用的PCR循环数较少。所以它PCR扩增效率不同，所引起的文库不均一程度也就较低。也就是我们通常所说的PCR bias较少。
为了解决文库丰富度受到损失的这个问题，EpiCentre公司开发了EpiGnome方法，方法的操作过程如图。
第2步，把带标签1的随机引物加入，进行第一次的复制。得到第1条的复制链。
第4步，是加入带末端终止碱基、并带标签2的随机引物。这个引物的作用是让第1复制链延伸，并且加上标签2。
第5步是加入建库的PCR引物，进行PCR。通过PCR，把Index序列和成簇引物序列加入到链的两侧。得到真正的文库。
这个方法的优点是，把亚硫酸氢盐处理的过程，放在了建库之前。这样建成的库的丰富程度会比较高。但是这个方法也有缺点，
测甲基化文库的问题、和解决方案在Illumina的HiSeq 2000或者2500平台上进行测序，如果文库是碱基平衡的文库，也就是说，每个特环当中，A/C/G/T四种碱基的比例，各占25%左右的话，测序仪对碱基的判读会比较好。
但是如果缺少了一种或者几种碱基，测序仪对碱基的判读就会出问题。测序得到的数据质量就会下降。并且效的数据产量也会降低。
关于文库碱基平衡度影响数据质量和产量的原因，在【陈巍学基因】第二期的视频，HiSeq义器的工作原理这一集中有介绍。大家可以在优酷当中找一下，并且看一下。
因为甲基化文库中经过亚硫酸氢盐处理，绝大多数的C都变成了T。所以，这个文库中是严重地缺少C碱基的，也就是四种碱基的比例是严重不平衡的。这样在用HiSeq 2000或2500测序仪来测甲基化文库的过程当中，文库测序得到的数据质理就较差。并且经过PF过滤得到的有效的数据产量也会较低。
也就是说，在HiSeq 2000或者2500平台上，甲基化文库的测序数据产量，一直都不是很高。质量也比较低。
在用单纯的亚硫酸氢盐法来测的过程当中，甲基化和差甲化的C碱基都不能被转化成U碱基，所以单纯的亚硫酸氢盐法是无法区分甲基化或羟甲基化的C碱基的。
）来氧化羟甲基化的C。羟甲基化的C可以被转化成甲酰化的C碱基，而甲酰化的C碱基，是可以被亚硫酸氢盐转化成U的。
而甲基化的C，不会被转化成U。这样就把原来的羟甲基化的C和甲基化的C给区分开来了。
经研究表明，用高钌酸钾氧化的方法来氧化羟甲基化的C，其转化效率是94%左右。也就是说，每100个羟甲基化的C中，有94个会被高钌酸钾转化成甲酰化的C。并进一步被亚硫酸氢盐转化成U。
进一步将羟甲基化的C转化成甲酰化的C和羧基化的C。甲酰化的C和羧基化的C都可以被亚硫酸氢盐转化成U。
而之前被糖基化保护起来的羟甲基化的C，是不会被TET蛋白转化成甲酰化的C或者羧基化的C的。在亚硫酸氢盐的处理过程中，它还保持是C。并且在之后的PCR扩增产物中，也表现为C。
用这个方法，没有甲基化的C，99.6%都被转化成了U。甲基化的C，97.7%都被转化成了U。而羟甲基化的C，只有8%被化成了U。
在甲基化文库建程当中，亚硫酸氢盐对未甲基化的C的转化效率并不是100%，一般是在99%左右。
一般情况下，是用甲基化酶缺陷型的大肠杆菌，所生产出来的完全没有被甲基化的λ（噬菌体）DNA，或者pUC19（质粒）DNA做内参。来看一次实验当中C的转化效率。
同样道理，也可以通过用甲基化酶处理过的，CpG岛完全被甲基化的DNA，来跟踪甲基化DNA对亚硫酸氢盐转化的抵抗效果。
因为亚硫酸氢盐处理过后，绝大部分的C都被转化成了T。这样，测出来的序列在和基因组进行对比的时侯，直接对比是对比不上的。
第一种转变是把基因组上所有的C都改到T，再来和测序测到的序列来对比。这样，就可以把原来的链给对比上。
第二种转变，是把基因组上所有的G都变成A，这样才能和经过PCR得到的原样本链睥互补链对比得上。这样做的原因，是原样本链的互被链，它上面绝大部分的G，都被变成了A。所以，只有把（参考）基因组上的G，也都改成A，这样才能对比得上。
比对上之后，再来看哪些碱基是没有被转化的。这样，就可以确认这些碱基的甲基化修饰情况了。
再接下来，针对基因进行GO和Pathway的分析。在【陈巍学基因】第8期视频，RNA-seq当中，对GO和Pathway有详细的介绍，大家可以在优酷或者腾讯视频当中搜一下，看一下。
DNA的甲基化分析，还有很多种方法，有兴趣的同学，可以在微信公众号【陈巍学基因】当中，回复“甲基”两个字，就可以看到7种其它分析DNA甲基化的方法。
Moleculo原来是美国的一家创业公司。这家公司开发了一种拼接长测序序列的方法。这个方法一经面世，就引起了Illumina的重视，Illumina马上出巨资，收购了这家公司。
在全新的基因组组装工作中，也就是我们通常所说的“De Novo”工作中，
。所以，得到长的读长序列，一直是做De novo工作的科学家所追求的有效技术手段。另外，
Illumina标准的HiSeq/MiSeq测序方法，提供了一次给出大量序列的方法。它的序列，精度也很高，每个G的数据的测序成本也很低，但是，相对于De novo工作来说，它的读长还是不够长。
举例来说，Illumina旗下测序长度最长的MiSeq测序仪它的测序长度是：双端各300个碱基。那么，我们把这双端的300个碱基拼起来，中间交错100个碱基，可以得到一个500碱基的读长，
那么，我们要用500碱基读长的序列来组装一个和人类基因组大小相近的一个基因组，也就是单倍体长度为30亿个碱基长度的基因组，就相当于用筷子那么长（25厘米）的铁轨，来拼出一个京沪铁路（1300公里）。大家稍微想一想，就可以想出其中的难度。
Moleculo方法，它的巧妙点就是可以把Illumina不算太长的序列，拼接成一个一个10KB读长的序列，然。
