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一种人脑干细胞库构建方法_2
[0018]然后，为进一步证明实验组的细胞是胆碱能神经元，将已作完ChAT免疫细胞化学染色的细胞用PBS终止显色以及进一步封闭非特异性结合位点后，仍用ABC法行Tujl免疫细胞化学染色，用含有NiCl的DAB和H202作为呈色剂，双标阳性细胞着色为蓝黑色。
[0019](H)冷冻:严格降防干细胞被杀。神经干细胞被提纯出来后，立刻进入冷冻室进行程控降，并加入细胞内外保护剂及防冻液，按照一定的时间和降速度进行冷冻，暂存在转移用液氮罐中。冷冻必须在严格的降曲红控制下进行，否则干细胞会被杀死。
[0020](I)登记储存:按照患者身份证信息登记，贴条形码进行保存，建立可供检索的细胞信息档案。零下196摄氏度长期保存，前面所有环节都没问题后，神经干细胞将进入最后的冷冻保存阶段。此前暂存在转移用液氮罐中的神经干细胞将被送到冷冻库进行集中储存。
[0021]上述延长神经干细胞存储时间方法为:神经干细胞较其它干细胞脆弱，生命力差，一般零下196摄氏度保存期为一年，为了延长保存期，我们发明了一种半年复苏再增值再保存的方法，可以将神经干细胞存储时间延长，由于这大大增加了成本，所以按患者的经济情况而定，一般最长保存时间可以达到10年。
[0022]该发明的有益效果在于:本发明的脑干细胞库构建方法，主要是改变了存储思路，中间再次复苏延长了存储时间，能够长时间存储才实现细胞库的功能。
[0023]下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。实施例
(I)GMP实验室及冷冻库的基础建设:脑细胞库由GMP实验室和冷冻库组成。
[0025](A) GMP实验室:拥有符合国际GMP标准的现代化层流实验室，总面积超过600平方米，分为:清洁区和非清洁区两部分:(a)非清洁区包括:办公区、值班室、库房、洗刷消毒间和准备间、空调机房、微生物检测室；(b)清洁区包括:男更衣室、女更衣室，洁净度为30万级；清洁走廊，洁净度为10万级；三个独立的细胞制备室，洁净度为万级；脑组织初采分离室，洁净度为万级；配液室，洁净度为万级；检测室，洁净度为万级；培养箱室，洁净度为万级。
[0026](B)冷冻库:冷冻库规模不同主要在于液氮罐数量，一般一个标准干细胞存储液氮罐能存储30万份干细胞，需要使用面积为8平米。一个覆盖一个省的脑细胞库，需要具备60万份存储量，一般需要冷冻库30平米，洁净度为万级。
[0027](2) GMP实验室质控建设:严格按照以下间充质干细胞操作培养规范进行，以确保质量控制:《临床人体干细胞体外制备质量保证制度及工作表》、《人神经干细胞分离培养标准作业程序》、《人神经干细胞分离培养标准作业程序》、《人神经干细胞传代培养标准作业程序》、《人神经干细胞收获标准作业程序》、《人神经干细胞冻存标准作业程序》、《人神经干细胞复苏标准作业程序》。
(A)采集脑细胞:对需要手术的脑出血、脑外伤患者，先向家属交代，手术只能进行止血、清除损伤的脑组织，但脑组织不能再生，损伤多少就减少多少，脑组织减少会对病人术后造成不同程度的影响，出现一定的残疾。目前有干细胞技术，使得脑细胞可以在体外进行增殖，将损伤的脑组织进行提取其中的神经干细胞，进行体外增值，然后冷冻储存，待病人以后所用。如病人家属同意，术中将清除的损伤坏死的脑组织保留，存放在无菌袋中，36小时内入库空运免检，为了保证不变质，采集后的脑组织将被迅速送到GMP实验室，本市24小时之内必须送到，外省市运送最多不能超过36小时(国际标准为72小时)。此外，运输过程也有严格要求，脑组织会被放入一个特殊容器，温度保持在4至25摄氏度之间。如果用飞机运送，脑组织在机场是免检的，因为一旦经过X光照射，脑组织中神经干细胞的质量将受到影响。
[0028](B)神经干细胞的分离和传代:冲洗脑组织，去除残留的血液，D-Hanks液充分漂洗后，用眼科剪将脑组织剪碎后，再转移到DMEM/F12(1:1)加B27和bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞浓度为5X 14?5个/ml，置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500 μ I。待神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，仍以5Χ 14个/ml的细胞浓度置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500 μ I。此后每7d机械分离克隆传代I次,方法同前。
[0029](C) BrdU标记:将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后加入神经球形成后再次机械分离克隆制作的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5 μ mol/L)，培养7d待新的神经球形成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。
[0030](D)神经干细胞的诱导分化:选取部分上述传代后形成的次代神经球种植于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并加入有血清培养基(含10%胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养，观察其生长分化情况。另将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后加入有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tujl ,GFAP ,Galc免疫细胞化学染色。
[0031](E)条件培养液的制备:取Ig鸡胚的后肢骨骼肌组织，加入9mlD-Hanks液中冰浴匀浆15min，离心获得上清液，过滤除菌后，加两倍体积DMEM/F12培养基制成条件培养液备用。
[0032](F)神经干细胞的定向诱导分化:将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后分别加入条件培养液和有血清培养基(含10%胎牛血清的DMEM/F12)中对照贴壁培养，7d后均行ChAT免疫细胞化学染色。
[0034]然后，为进一步证明实验组的细胞是胆碱能神经元，将已作完ChAT免疫细胞化学染色的细胞用PBS终止显色以及进一步封闭非特异性结合位点后，仍用ABC法行Tujl免疫细胞化学染色，用含有NiCl的DAB和H202作为呈色剂，双标阳性细胞着色为蓝黑色。
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