联系热线：0577-65576766
一种大规模、高通量、高安全性干细胞库的构建方法与流程
本发明属于干细胞领域，特别涉及一种大规模、高通量、高安全性干细胞库的构建方法。
干细胞库为三级管理，即初级干细胞库(种子干细胞库)、主干细胞库及工作干细胞库。
初级干细胞库(pre-mastercellbank，pcb)：初级细胞又名细胞种子(cellseed)，指来源于单一个体的组织或细胞，经过一定方式培养而成的、并经鉴定性质均一的细胞群体。初级干细胞库是指分装于一定数量、并在一定条件下贮存初级细胞的容器集合。初级干细胞库的贮存细胞经检定合格后可用于制备主干细胞库。
主干细胞库(mastercellbank，mcb)：由初级干细胞库的细胞培养至特定倍增水平或传代水平，经一次制备获得的、性质均一的细胞群体，分装于一定数量，并在一定条件下贮存的容器集合。主干细胞库的贮存细胞经检定合格后可用于制备工作干细胞库或细胞制剂。
工作干细胞库(workingcellbank，wcb)：由主干细胞库的细胞经培养至特定倍增水平或传代水平，并经一次制备获得的、性质均一的细胞群体，分装于一定数量，并在一定条件下贮存的容器集合。工作干细胞库的贮存细胞经检定合格后可用于制备细胞制剂。
在干细胞库建设过程中，完成高质量的细胞制备后，如何有效的长期稳定保存细胞尤为重要，故：细胞冻存技术作为干细胞库建设的核心技术。
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤，常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器。
按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化冻存和玻璃化冻存两种。
玻璃化冻存法是指利用各种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法，以这种方法冻存的细胞悬液没有冰晶的形成；玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，其存活率可达90％以上，不要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用，因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性(但在4℃时毒性大为减弱)。所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在4℃冰浴中进行，另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡，目前，该方法已在胚胎干细胞冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存，这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。
非玻璃化冻存是用各种温级的冰箱将干细胞分阶段降温至-70℃到-80℃，然后直接投入液氮进行保存，或者是利用计算机程控降温以及利用液氮的气、液，按一定的速率从室温降至-100℃以下，再直接投入液氮的保存方法，这种冻存方法也能获得较高的细胞存活率。
目前细胞冻存最常用的仍是非玻璃化，目前市售的冻存管主要用于非玻璃化法的细胞冻存技术；市售的麦管主要应用于玻璃化法的细胞冻存技术，且主要应用于生殖细胞的冻存与复苏领域。
传统的干细胞库建设过程中，主要采用冻存管作为干细胞库的保存介质，冻存及复苏操作主要依赖人工，大批量建库过程中的工作量较大且容易出错。为了解决以上技术问题，本发明的设计、开发了应用麦管非玻璃化冻存细胞技术，建立一种大规模、高通量、高安全性的干细胞库建库技术和方法。
本发明提供了一种大规模、高通量、高安全性干细胞库的构建方法，该构建方法主要包括以下步骤：
s2：将内置有冻存后的干细胞混悬液的麦管放置于埋伏式恒温金属浴中进行复苏。
麦管端部的塞子有两类，由两种聚胺纤维织物组成、六种颜色，方便区分，由0.22um的疏水性薄膜构成，只能通过空气，液体和细菌都不能通过，麦管容积分为0.3ml、0.5ml两种。本发明提供的方法适用于多种干细胞，如：脐带间充质干细胞、子宫内膜间充质干细胞、脂肪干细胞、胎盘干细胞等；本发明在研发过程中发现使用冻存管冻存干细胞时，复苏时间长，且不均匀，导致复苏后干细胞的存活率、复苏率和回收率等下降，复苏效果差。研究发现将本领域常用于玻璃化冻存方法的麦管应用于非玻璃化冻存时，配合埋伏式恒温金属浴复苏方法，能够显著提高复苏效率，大幅度提高复苏后干细胞的存活率、复苏率和回收率等指标。
s11：通过麦管自动灌装标识系统将干细胞悬液自动灌装到麦管中，并对灌装干细胞悬液后的麦管进行封口、打印、识别；
s13：通过麦管冷冻存储系统盛装程序降温后的麦管，并放入液氮罐内进行冻存。
传统的干细胞库建设过程中，冻存管冻存细胞主要依赖于人工分装，人工分装的均一性差，操作条件受限且容易产生污染；本发明通过麦管自动灌装标识系统代替人工灌装，减少人工操作，增加分装的均一性。传统的干细胞库建设过程中，人工旋开冻存管盖、分装1ml细胞悬液到冻存管，旋紧冻存管盖，整体平均速率为80-120管/小时；本发明应用麦管自动化灌装设备无菌灌装细胞悬液，平均灌装、打码速率为240-280管/小时，提高了工作效率。传统的干细胞库建设过程中，冻存管需要人工悬盖，人工旋盖如果旋不紧，有交叉污染的风险；应用麦管自动灌装标识系统的热合封口技术，将麦管的两端进行高温热合，有效的降低了交叉污染的风险。传统的干细胞库建设过程中，主要采用向冻存管壁黏贴已经打印的超低温标签，或者手工写编码，需要大量的人工操作时间，且黏贴的标签通常容易脱落；本发明应用麦管自动喷码设备，可以在麦管中部喷涂国际通用的一维码(128码)，喷涂的油墨耐低温(-196℃条件)，编码作为细胞样本的唯一性标识，可更好的实现追溯管理。
进一步地，步骤s2将内置有冻存后的干细胞混悬液的麦管放置于埋伏式恒温金属浴中进行复苏是在37℃条件下进行的。
传统的干细胞库建设过程中，将冻存管放到水浴锅或者放到支持物(如浮漂)上放到水浴锅中复苏，由于冻存管较粗，复苏时间通常要1-3min，且复苏不均匀，本发明应用埋伏式恒温金属浴麦管专用复苏仪将麦管放入专用的复苏仪中，最长60秒即可实现复苏过程，实现了非玻璃化冻存的均匀、快融原则。
进一步地，冻存或复苏过程中还包括安全运输，安全运输是通过干式液氮罐将程序降温后的麦管运输至冷冻存储系统内进行冻存，或通过干式液氮罐将冷冻存储系统中的麦管运输至埋伏式恒温金属浴中复苏。
进一步地，步骤s12程序降温是将程序降温盒放入-80℃的冰箱内保持12h。
进一步地，步骤s11麦管自动灌装标识系统包括：控制箱、喷码机、识别设备、灌装设备和热合设备；
控制箱用于控制灌装设备对麦管进行灌装，喷码机用于在麦管上喷码，识别设备用于识别麦管上的条形码，热合设备用于对灌装干细胞悬液后的麦管进行热合封口；
灌装设备包括源样本袋、与源样本袋连通的注液管、与注液管连接的蠕动泵、与注液管底端连接的出液管，出液管向麦管内灌装干细胞悬液，源样本袋的出液端与注液管的端部密封连接，源样本袋上设有震动装置。
本发明将传统的麦管自动灌装系统进行改进，将原开管静态的进样装置改进为密闭垂直旋转混匀的进样装置，有效的保证了细胞的无菌条件，同时保证了分装的细胞悬液的密度均一。
进一步地，步骤s12麦管程序降温系统是将麦管放入麦管程序降温盒内进行程序降温，程序降温盒包括顶端开口的盒体和与盒体配套的盒盖，盒体由eva泡绵制成，盒体内等间隔设有若干个竖直的eva泡绵板，相邻两个eva泡绵板之间设有导热芯，eva泡绵板和/或盒体上设有多个麦管插槽。
进一步地，导热芯的数量为3个，eva泡绵板的数量为2个，盒体的厚度为10mm，盒体的尺寸为长120mm*宽70mm*高155mm，盒盖的高度为20mm，导热芯和eva泡绵板的尺寸均为长100mm*宽10mm*高140mm，每个eva泡绵板以及两个与eva泡绵板相平行的盒体的侧壁上均设有24个麦管插槽。
传统的干细胞库建设过程中，传统的程序降温盒/程序降温仪一次性处理的样本数量较少，通常为12个；本发明提供的麦管专用程序降温盒可用于盛装灌装有干细胞悬液的麦管，再将其放置于-80℃的冰箱内进行程序降温，降温过程中，各麦管的降温速度较一致，且相对于常规程序降温盒一次性冻存12个冻存管，本申请提供的麦管专用程序降温盒可一次性冻存96个麦管。
进一步地，步骤s13麦管冷冻存储系统是先将麦管放入冻存盒内，再将冻存盒放置于冻存架，再将冻存架放置于液氮罐内进行冻存，麦管专用冻存盒包括壳体和与壳体配合的盖子，壳体内设有网状隔离槽，网状隔离槽的每个隔离槽内均设有塑料柱状体，每个塑料柱状体上均设有若干麦管冻存槽；麦管专用冻存架包括侧面开口的框架，框架由下至上等间隔设有若干个隔板，隔板的长度和宽度大于冻存盒的长度和宽度，相邻两个隔板之间的距离大于冻存盒的高度。
每个常规冻存盒可放置9*9＝81支，本发明的每个麦管专用冻存盒可放置9*12*12＝1296支，本发明提供的麦管专用冻存盒比传统的冻存管配套冻存盒多近16倍的存储样本数量，冻存盒可以独立放入移动干式液氮罐中，方便运输，也可将冻存盒放置于麦管专用冻存架内，再将冻存架放置于液氮罐内，方便取放；每个常规冻存架可放置81*10＝810支冻存管，每个麦管专用冻存架可放置3个麦管专用冻存盒，即每个麦管专用冻存架可放置1296*3＝3888支麦管；本发明提供的冻存架比传统的冻存架可存储多近5倍的存储样本数量
进一步地，壳体相对的两个外侧壁水平设有通槽，框架左侧壁和右侧壁分别设有与通槽相适配的凸块，隔板上方设有挤压板，挤压板与隔板之间垂直设有弹簧。
本发明提供的大规模、高通量、高安全性干细胞库的构建方法具有以下技术效果：本发明将本领域常用于玻璃化冻存方法的麦管应用于非玻璃化冻存，配合埋伏式恒温金属浴复苏方法，能够显著提高复苏时间和复苏的均匀度，大幅度提高复苏后干细胞的贴壁率、复苏率和回收率等指标，实现了非玻璃化冻存的快融原则，最大限度保持细胞复苏活性。
本实施例提供了一种灌装设备，该如图3所示，灌装设备包括源样本袋1、与源样本袋1连通的注液管2、与注液管2连接的蠕动泵3、与注液管2底端连接的出液管4，出液管4向麦管内灌装干细胞悬液，源样本袋1的出液端与注液管2的端部密封连接，源样本袋1上设有震动装置5。
实施例1通过设置源样本袋的出液端与注液管的端部密封连接，有效的保证了细胞的无菌条件，同时通过设置震动装置保证了分装的细胞悬液的密度均一。
本实施例提供了一种程序降温盒，该如图4所示，该程序降温盒包括顶端开口的盒体6和与盒体6配套的盒盖7，盒体6由eva泡绵制成，盒体6内等间隔设有若干个竖直的eva泡绵板8，相邻两个eva泡绵板8之间设有导热芯9，eva泡绵板8和/或盒体6上设有多个麦管插槽10；导热芯9的数量为3个，eva泡绵板8的数量为2个，盒体的厚度为10mm，盒体的尺寸为长120mm*宽70mm*高155mm，盒盖的高度为20mm，导热芯9和eva泡绵板8的尺寸均为长100mm*宽10mm*高140mm，每个eva泡绵板8以及两个与eva泡绵板8相平行的盒体6的侧壁上均设有24个麦管插槽10。
其中，盒体与盒盖相适配，也可以通过转轴连接，本实施例不做具体限定，盒体通过eva泡绵材质制成，eva泡绵板与盒体一体成型，导热芯由合金材料制成；本实施例提供的专用于麦管的程序降温盒可用于盛装灌装有干细胞悬液的麦管，再将其放置于-80℃的冰箱内进行程序降温，降温过程中，各麦管的降温速度较一致，且相对于常规程序降温盒一次性冻存12个冻存管，本申请提供的麦管专用程序降温盒可一次性冻存96个麦管。
本实施例提供了一种冻存盒和冻存架，如图5和图6所示，麦管专用冻存盒包括壳体11和与壳体11配合的盖子，壳体11内设有网状隔离槽13，网状隔离槽的每个隔离槽11内均设有塑料柱状体12，每个塑料柱状体12上均设有若干麦管冻存槽14；如图7所示，麦管专用冻存架包括侧面开口的框架15，框架由下至上等间隔设有若干个隔板16，隔板16的长度和宽度大于冻存盒的长度和宽度，相邻两个隔板16之间的距离大于冻存盒的高度，框架15的顶端设有把手。
其中，盖子与壳体的配合方式包括套接、轴连接和卡接等，壳体为顶端开口的盒子，由pvc材质制成，本示例提供的麦管专用冻存盒可用于冻存大批量的麦管，冻存架由不锈钢材质制成；每个常规冻存盒可放置9*9＝81支，本发明的每个麦管专用冻存盒可放置9*12*12＝1296支，本发明提供的麦管专用冻存盒比传统的冻存管配套冻存盒多近16倍的存储样本数量，冻存盒可以独立放入移动干式液氮罐中，方便运输，也可将冻存盒放置于麦管专用冻存架内，再将冻存架放置于液氮罐内，方便取放；每个常规冻存架可放置81*10＝810支冻存管，每个麦管专用冻存架可放置3个麦管专用冻存盒，即每个麦管专用冻存架可放置1296*3＝3888支麦管；本发明提供的冻存架比传统的冻存架可存储多近5倍的存储样本数量。
本实施例提供了一种冻存盒和冻存架，与实施例3的不同之处在于，如图8和图9所示，壳体11相对的两个外侧壁水平设有通槽17，框架15左侧壁和右侧壁分别设有与通槽17相适配的凸块18，隔板16上方设有挤压板19，如图10所示，挤压板19与隔板16之间垂直设有弹簧20。
其中，凸块可与框架一体成型，弹簧与挤压板和隔板均固定连接，挤压板的厚度与弹簧压缩后的长度、冻存盒的高度之和小于相邻两个隔板之间的距离，通槽和凸块的横截面可以是图1的半圆形，也可以是正方形或长方形等，本发明不做具体限定；使用时将麦管专用冻存盒的壳体上的两个通槽对应框架的两个凸块插入相邻两个隔板之间，此时向下按压挤压板，挤压板向下运动压缩弹簧，当将麦管专用冻存盒全部放入两个隔板之间后松手，压缩弹簧向上的弹力将麦管专用冻存盒牢固地挤压在两个隔板之间，避免出现麦管专用冻存架中的麦管专用冻存盒处于液氮罐中时受力发生移动。
本实施例提供了一种大规模、高通量、高安全性干细胞库的构建方法，如图1所示，该构建方法主要包括以下步骤：
s11：通过麦管自动灌装标识系统将干细胞悬液自动灌装到麦管中，并对灌装干细胞悬液后的麦管进行封口、打印、识别；
s12：将麦管放入实施例2提供的麦管程序降温盒内，再将程序降温盒放入-80℃的冰箱内保持12h进行程序降温；
s13：先将麦管放入实施例3的冻存盒内，再将实施例3的冻存盒放置于实施例3的冻存架，再将实施例3的冻存架放置于液氮罐内进行冻存；
冻存过程中还包括安全运输，安全运输是通过干式液氮罐将程序降温后的麦管运输至冷冻存储系统内进行冻存；
步骤s11麦管自动灌装标识系统包括：控制箱、喷码机、识别设备、实施例1提供的灌装设备和热合设备；
控制箱用于控制灌装设备对麦管进行灌装，喷码机用于在麦管上喷码，识别设备用于识别麦管上的条形码，热合设备用于对灌装干细胞悬液后的麦管进行热合封口；
s2：将冻存后的干细胞混悬液放置于埋伏式恒温金属浴中，调节温度为37℃进行复苏；
如图2所示，先将埋伏式金属浴调节温度为37℃，判断温度是否调整准确，若不准确，则重新调整，若准确，从液氮罐中取出麦管，放入预热的埋伏式金属浴中，判定细胞融化状态，如果融化，则无菌减去封头，得到细胞悬液，如果不融化，则继续放入预热的埋伏式金属浴中复苏直到融化为止。
制备1.0*106个/ml脐带间充质干细胞悬液22ml(有2ml余量)，细胞计数及活率测定(台盼蓝拒染法)3次求平均值，加入10％的dmso待用。
试验组将脐带间充质干细胞悬液按照实施例5的方法灌装到20支麦管中，对照组将脐带间充质干细胞悬液灌装到20支冻存管中，分别密封后放入4℃预冷的程序降温盒-80℃冷冻12h，转入冻存盒后放入液氮罐中的相同高度位置冻存，对照组使用常规的冻存管、程序降温盒和冷冻盒，冻存管为康宁冻存管，货号430659、程序降温盒为康宁coolcelllx程序降温盒，货号432001，冷冻盒为cryoking，型号98-1213。
一周后，从液氮中取出装有脐带间充质干细胞悬液的试验组的麦管及对照组的冻存管，冻存管放入37℃水浴锅中复苏120s，麦管放入37℃埋伏式金属浴中复苏60s，对每管复苏后的脐带间充质干细胞悬液进行计数及活率测定。
计算细胞回收率：细胞脐带间充质干回收率＝复苏后的脐带间充质干细胞总数/复苏前的脐带间充质干细胞总数。
计算细胞复苏率：细胞脐带间充质干复苏率＝复苏后的脐带间充质干细胞活率/复苏前的脐带间充质干细胞活率；
通过实验结果分析可得：麦管组复苏后的细胞活率显著高于冻存管组(p0.05)；麦管组与冻存管组复苏后的回收率无显著差异(p0.05)；麦管组复苏后的复苏率显著高于冻存管组(p0.05)。
综上，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。
针对罕见病基因检测标准化不足的问题，提出构建含hTERT/SV40LT逆转录病毒载体的永生化杂交瘤细胞株，通过G418/PM联合筛选获得可稳定传代的全基因组载体，用于制备质控参考株及永生基因库...
针对传统药物筛选效率低的问题，提出DNA编码动态分子库合成与筛选方法。通过将含活性基团的A/B组结构单元与DNA连接，利用可逆化学反应构建动态库，再通过靶蛋白富集、平衡锁定及PCR测序，快速识...
针对传统间充质干细胞培养中存在外源血清污染及纯度低的问题，提出采用胶原酶II消化组织并结合红细胞裂解液纯化技术，配合专用无血清培养基和冻存液，实现细胞高效扩增与临床级制备。该方法操作简便，显著...
针对传统DNA编码分子库筛选依赖纯化固载蛋白靶点、难以处理膜蛋白等复杂靶点的瓶颈问题，提出引入带光交联基团的短链DNA技术。通过光照使靶点结合的小分子DNA标签被交联保护，未结合分子则被外切酶...
提出一种高效构建人毛囊干细胞库的方法，针对传统技术中毛囊干细胞资源难以长期保存、活性低的问题，通过优化毛发采集、无菌分离、定向培养及程序化冻存流程，实现干细胞的规模化扩增与稳定保存，为临床治疗...
针对传统的TALE单体库构建繁琐、效率低的问题，提出了一种高效的TALE聚体库构建方法。该方法首先扩增16类TALE单体混合物，再通过酶切连接和进一步扩增获得五聚体、三聚体、二聚体及单体混合物...
提出了一种检测间充质干细胞体外传代过程中基因组稳定性的方法。针对干细胞临床应用中的基因组稳定性问题，采用从细胞分离、短期传代冻存建库、长期传代培养、提取不同代次DNA及高通量分析的步骤，评估并...
1.CRISPR-Cas系统 2.基因编辑 3.基因修复 4.天然产物合成 5.单分子技术开发与应用
1.探索新型氧化还原酶结构-功能关系，电催化反应机制 2.酶电催化导向的酶分子改造 3.纳米材料、生物功能多肽对酶-电极体系的影响4. 生物电化学传感和生物电合成体系的设计与应用。
1.环境纳米材料及挥发性有机化合物（VOCs）染物的催化氧化 3.低温等离子体 4.吸脱附等控制技术
1.高分子材料改性及加工技术 2.微孔及过滤材料 3.环境友好高分子材料
1.高分子材料的共混与复合 2.涉及材料功能化及结构与性能的研究； 高分子热稳定剂的研发
